消化道惡性腫瘤患者外周血單個核細胞線粒體功能的初步研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤一直以來是嚴重危害人類健康的一類疾病，在世界范圍內(nèi)，消化道惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均較高。為了闡明惡性腫瘤的形成機制，更好地防治惡性腫瘤，一百多年來人們提出了多個惡性腫瘤形成假說，其中“免疫監(jiān)視假說”被廣泛接受，尤其是近年來基于該假說的免疫（細胞）治療技術(shù)在惡性腫瘤的治療領(lǐng)域取得舉世矚目的突破和進展?；谠摷僬f，免疫系統(tǒng)具有識別、殺傷并及時清除體內(nèi)突變細胞，防止腫瘤發(fā)生的功能。當機體免疫功能降低時，腫瘤的發(fā)生率明顯升高，同

2、時腫瘤進行性浸潤生長進一步抑制患者的免疫功能。已有研究發(fā)現(xiàn)：惡性腫瘤患者的細胞免疫功能普遍低下，腫瘤患者外周血T淋巴細胞亞群的數(shù)量和NK細胞的活性均顯著下降；小鼠RAG-2基因的敲除對宿主腫瘤影響佐證了免疫監(jiān)視系統(tǒng)的存在。由于免疫細胞的功能直接或間接依賴于細胞內(nèi)ATP的能量供應(yīng)，而線粒體是細胞的能量工廠，主要通過氧化磷酸化為細胞提供動力?；诖耍覀兲岢隽恕巴庵苎庖呒毎€粒體功能降低與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)”的假說。
　　目的：本課題

3、通過對消化道惡性腫瘤患者與健康人外周血單個核細胞線粒體功能的病例對照研究，探討外周血單個核細胞線粒體功能改變與消化道惡性腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系，以驗證我們提出的假說，并為今后深入研究惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制以及診斷和治療等提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.研究對象：消化道惡性腫瘤患者來自天津腫瘤醫(yī)院，所有入選病例組的患者均為首次確診為消化道腫瘤（胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌），所有入組研究對象均未進行過手術(shù)切除、放化療。正常對照組來自在同

4、一時期中國人民解放軍第272醫(yī)院門診健康體檢人員，沒有腫瘤史。對照組與病例組研究對象的年齡、性別構(gòu)成無明顯差別。所有研究對象均為漢族。
　　2.外周血單個核細胞分離：采集肘靜脈血，EDTA-K2抗凝，于室溫1600×g離心10min，上層血漿分裝后于-80℃保存待用。采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞(PBMCs)，主要包括T、B淋巴細胞，NK細胞和單核細胞。
　　3.機體氧化/抗氧化水平的檢測：利用DCFH

5、-DA探針測定外周血單個核細胞ROS含量。Mito SOX線粒體紅色熒光探針測定外周血單個核細胞線粒體ROS，分光光度計檢測血漿總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力和丙二醛（MDA）的含量。
　　4.外周血單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測：提取腫瘤患者與健康人外周血單個核細胞總DNA，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time Quantitative Polymerase Chain React

6、ion，real-time qPCR）測定入選病例組及對照組研究對象外周血單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)。
　　5.外周血單個核細胞線粒體功能的檢測：外周血單個核細胞經(jīng)羅丹明123（Rhodamine123）染色后，應(yīng)用流式細胞術(shù)分別測定CD3+CD19-T細胞、CD3-CD19+B細胞、CD3-CD56+NK細胞、CD14+單核細胞線粒體膜電位；裂解外周血單個核細胞后，螢火蟲熒光素酶法測定三磷酸腺苷(adenosine triph

7、osphate，ATP)含量，結(jié)果以nmol/mg蛋白表示。
　　6.統(tǒng)計學分析：對檢測結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-X±S)表示。對于定性數(shù)據(jù)，比較各組的分布差別時用卡方檢驗；對于定量數(shù)據(jù)，比較各組的差別時用單因素方差分析，用SNK法進行兩兩比較。各檢驗方法的顯著性水平為雙側(cè)P＜0.05。
　　結(jié)果：
　　1.研究對象一般資料的分布特征：
　　消化道腫瘤病例組與正

8、常對照組在性別（P=1.00）、年齡（56.68±8.42 vs57.20±6.81歲，P=0.68）、長期居住地(天津)、吸煙（P=0.89）、飲酒（P=0.79）、生活方式等混雜因素上具有很好的匹配性。正常對照組（60人）：男性36例，女性24例，平均年齡：57.20歲。各型消化道腫瘤患者（90人）：肝癌患者男性18例，女性12例，平均年齡：56.23歲；胃癌患者男性18例，女性12例，平均年齡：55.8歲；結(jié)直腸癌患者男性18例，

9、女性12例，平均年齡：58歲。
　　2.消化道惡性腫瘤患者氧化/抗氧化指標的變化情況：
　　2.1 腫瘤患者血漿氧化/抗氧化水平：
　　血漿T-AOC、GSH-PX活力、MDA含量在正常對照組分別為4.22±1.21U/ml、346.00±45.34U/ml、3.06±0.59nmol/mL，消化道腫瘤組分別為0.88±0.33U/ml、240.77±44.77U/ml、4.78±1.42nmol/mL，表明消化道腫瘤

10、組血漿T-AOC、GSH-PX活力均顯著低于正常對照組（P＜0.01）；血漿MDA含量顯著高于正常對照組（P＜0.01）。本實驗對不同類型消化道腫瘤患者進一步分析發(fā)現(xiàn)血漿T-AOC在胃癌（0.87±0.38U/ml）、肝癌（0.95±0.33U/ml）、結(jié)直腸癌患者（0.83±0.27U/ml）均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。血漿GSH-PX活力在胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌分別為：223.84±43.23U/ml、243.27±53.0

11、8U/ml、255.21±30.75U/ml，均顯著低于正常對照組（ P＜0.01）。血漿 MDA含量在胃癌（4.99±1.67nmol/mL）、肝癌（4.65±1.39nmol/mL）、結(jié)直腸癌（4.69±1.19nmol/mL）均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。血漿氧化/抗氧化水平在不同類型腫瘤、不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　2.2 消化道腫瘤患者外周血單個核細胞氧化水平：
　　正常對照組外

12、周血單個核細胞ROS與線粒體ROS分別為284.69±58.89、20.91±4.19，而消化道腫瘤組分別為421.69±108.11、46.33±12.01，可見消化道腫瘤組與正常對照組相比，單個核細胞ROS與線粒體ROS均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。進一步分析發(fā)現(xiàn)：單個核細胞ROS在胃癌（422.30±110.8）、肝癌（424.58±97.39）、結(jié)腸癌（418.18±118.69）均顯著高于正常對照組（P＜0.

13、01）。單個核細胞線粒體ROS在胃癌（43.32±8.31）、肝癌（46.11±12.14）、結(jié)腸癌（49.56±14.34）均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。單個核細胞ROS與線粒體ROS含量在不同類型腫瘤、不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3.消化道腫瘤患者外周血單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)：
　　消化道腫瘤組外周血單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)（1.12±0.56）與正常對照組（4.84±1.9

14、0）相比顯著降低（P＜0.01）。不同類型消化道腫瘤外周血單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)：胃癌（0.93±0.64）、肝癌（1.22±0.60）、結(jié)直腸癌（1.21±0.39）均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)在不同類型腫瘤間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），并且腫瘤患者單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.消化道腫瘤患者外周血單個核細胞線

15、粒體功能的變化情況：
　　4.1 外周血單個核細胞線粒體膜電位的變化情況：
　　外周血單個核細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞線粒體膜電位正常對照組分別為：2809.96±311.54、1567.15±188.66、3206.51±326.87、2512.41±501.76、3127.20±458.74；消化道腫瘤組分別為：1125.88±313.99、1011.38±185.62、1480.98±352.69、129

16、0.40±340.47、1360.83±436.14，可見消化道腫瘤組不同細胞線粒體膜電位均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。胃癌組單個核細胞線粒體膜電位（1171.94±478.86）、T細胞線粒體膜電位（1024.18±140.16）、B細胞線粒體膜電位（1545.99±67.85）、NK細胞線粒體膜電位（1358.99±481.15）、單核細胞線粒體膜電位（1381.11±514.54）與正常對照組相比均顯著下降（P＜0.01）

17、；肝癌組單個核細胞線粒體膜電位（1053.43±196.71）、T細胞線粒體膜電位（937.30±196.55）、B細胞線粒體膜電位（1476.68±309.56）、NK細胞線粒體膜電位（1226.63±159.94）、單核細胞線粒體膜電位（1308.02±431.87）與正常對照組比較均顯著下降（ P＜0.01）；結(jié)直腸癌組單個核細胞線粒體膜電位（1152.28±161.92）、T細胞線粒體膜電位（1072.65±194.24）、B細

18、胞線粒體膜電位（1420.28±373.64）、NK細胞線粒體膜電位（1285.57±299.30）、單核細胞線粒體膜電位（1393.36±357.93）與正常對照組相比均顯著下降（P＜0.01）。不同類型腫瘤間各細胞線粒體膜電位無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），并且腫瘤患者各細胞線粒體膜電位在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.2 消化道腫瘤患者外周血單個核細胞ATP含量變化情況
　　外周血單個核細胞A

19、TP含量正常對照組為15.18±5.15，消化道腫瘤組為6.96±2.16 （P＜0.01）。不同類型消化道腫瘤的進一步分析發(fā)現(xiàn)胃癌（7.34±2.05）、肝癌（6.49±2.31）、結(jié)直腸癌（7.04±2.11）ATP含量均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。外周血單個核細胞ATP含量在不同腫瘤組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），并且腫瘤患者外周血單個核細胞ATP含量在不同年齡組、性別間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

20、　　結(jié)論：
　　1.消化道惡性腫瘤患者存在氧化/抗氧化失衡，表現(xiàn)為：血漿T-AOC與GSH-PX活力顯著下降；血漿MDA含量上升；外周血單個核細胞ROS含量與線粒體ROS含量均明顯升高。
　　2.消化道惡性腫瘤患者外周血單個核細胞線粒體DNA的拷貝數(shù)明顯降低。
　　3.消化道惡性腫瘤患者外周血單個核細胞線粒體功能降低，即：線粒體膜電位明顯下降，ATP合成明顯減少。
　　綜上所述，消化道腫瘤患者機體的氧化/抗氧化系