肺腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞集落培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:腫瘤干細(xì)胞(TSC)學(xué)說(shuō)提示腫瘤組織中存在極少部分腫瘤干細(xì)胞，其主要特點(diǎn)是自我更新、無(wú)限增殖的潛能和強(qiáng)致瘤性，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。肺癌是目前中國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌占肺癌總數(shù)的30％-40％，是肺癌最常見(jiàn)的組織類型之一。有研究者發(fā)現(xiàn)肺腺癌起源于氣道干細(xì)胞，氣道干細(xì)胞屬于氣道末段細(xì)支氣管肺泡導(dǎo)管連接處的細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞，肺腺癌被認(rèn)為是一種干細(xì)胞疾病，研究者認(rèn)為靶向殺滅肺癌干

2、細(xì)胞才可能是根治肺癌的有效治療手段。尤其是近10余年的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞可以扮演轉(zhuǎn)移灶的“種子”細(xì)胞角色，研究者認(rèn)為“轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞=腫瘤干細(xì)胞”。目前從血液循環(huán)中檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞已經(jīng)是被認(rèn)可的臨床技術(shù)，并且可從中分離培養(yǎng)出腫瘤干細(xì)胞。雖然該技術(shù)可檢測(cè)與分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，但費(fèi)用昂貴，這限制了其在科研和臨床的應(yīng)用與推廣，目前尚缺乏簡(jiǎn)單便宜的分離培養(yǎng)方法，而且也缺乏后續(xù)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的技術(shù)。由于肺腺癌的腫瘤干細(xì)胞起源于正常組織的

3、干細(xì)胞，兩者生物學(xué)特性有許多相似之處，因此，本研究嘗試采用人造血干細(xì)胞甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對(duì)肺腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)，并嘗試進(jìn)行集落細(xì)胞的體外培養(yǎng)，為明確腫瘤干細(xì)胞特點(diǎn)提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:本研究采用人造血干細(xì)胞甲基纖維素半固體培養(yǎng)基營(yíng)造干細(xì)胞集落生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)肺腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)及采用DMEM培養(yǎng)基對(duì)集落細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以求達(dá)到以下目的:
　?、偬剿鞣蜗侔┗颊咄庵苎窃煅杉?xì)胞存在

4、的可能性;
　　②探索采用人造血干細(xì)胞甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)出非造血干細(xì)胞集落的可能性及集落培養(yǎng)的情況;
　?、厶剿鞑捎肈MEM液體培養(yǎng)基對(duì)肺腺癌患者外周血非造血干細(xì)胞集落細(xì)胞的體外培養(yǎng)情況。
　　方法:選取肺腺癌患者10例，患者病情的臨床TNM分期為T2N1M1a-T4N3M1c。對(duì)各例患者均抽取外周血10mL，利用Ficoll-PaqueTMPLUS分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基（含重組人干細(xì)胞因子

5、等適合干細(xì)胞的生長(zhǎng)因子）對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞、集落的生長(zhǎng)情況，描述集落生長(zhǎng)形態(tài)和生長(zhǎng)曲線，辨析出非造血干細(xì)胞克隆類型，并挑選非造血干細(xì)胞集落進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)為CD34與CD44，挑取非造血干細(xì)胞集落，機(jī)械分離后，在體外完全培養(yǎng)基條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并觀察其體外培養(yǎng)情況。
　　結(jié)果:本研究共進(jìn)行10例肺腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞集落培養(yǎng)研究，每一份培養(yǎng)物加入細(xì)胞量為(2.2±0.149)×105個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)2周左

6、右培養(yǎng)，每一份培養(yǎng)物的細(xì)胞集落平均為120.70±27.893個(gè)，細(xì)胞集落生長(zhǎng)曲線顯示:在培養(yǎng)第5-7天細(xì)胞開(kāi)始聚集成團(tuán)狀，第8-10天小型、初步細(xì)胞集落形成，第14-16天細(xì)胞集落形成，集落類型主要為BFU-E樣、CFU-G樣和CFU-GEMM樣集落，其中，BFU-E樣與CFU-GEMM樣集落周邊出現(xiàn)“鋪路石”狀細(xì)胞集落，呈密集片狀，細(xì)胞間界限不清，挑取該細(xì)胞集落進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)CD34與CD44雙標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群體是CD34low

7、CD44high特點(diǎn)的細(xì)胞群體。進(jìn)一步挑取上述不同類型集落進(jìn)行體外完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并連續(xù)8周觀察，均未發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的生成與增殖。
　　結(jié)論:
　?、僭诜蜗侔┗颊咄庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞中，非造血干細(xì)胞存在的可能性是有的;
　?、诓捎萌嗽煅杉?xì)胞甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)出非造血干細(xì)胞集落的可能性非常大，可能是源于“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”;
　?、酆芸赡艽嬖诘姆窃煅杉?xì)胞的體外培養(yǎng)需要進(jìn)一步在培養(yǎng)基成分調(diào)整、實(shí)驗(yàn)技術(shù)提高的情況下進(jìn)行。