十二指腸空腸旁路術(shù)改善T2DM大鼠糖代謝并減少肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 建立2型糖尿病大鼠模型并評(píng)價(jià)十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠糖代謝的影響
　　十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)非肥胖2型糖尿病的治療效果已得到廣泛認(rèn)可，但是其機(jī)制不明確，需要更為深入地研究。
　　目的：
　　本部分研究選擇以高脂飲食及小劑量鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型為研究對(duì)象，首先對(duì)建立的糖尿病大鼠模型進(jìn)行評(píng)估，然后實(shí)施十二指腸空腸旁路

2、術(shù)，評(píng)價(jià)十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)糖代謝指標(biāo)的影響。
　　方法：
　　本部分研究通過高脂飼料喂養(yǎng)的方法誘導(dǎo)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，腹腔內(nèi)注射小劑量STZ(35mg/kg)誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。通過測(cè)定其空腹血糖、隨機(jī)血糖及胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)對(duì)建立的糖尿病大鼠模型進(jìn)行評(píng)估。對(duì)建模成功的大鼠分別實(shí)施十二指腸空腸旁路術(shù)(duodenal-jejun

3、al bypass，DJB)及假手術(shù)(SHAM)，以正常SD大鼠作為空白對(duì)照(CON)，在特定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)或計(jì)算:(1)各組大鼠的體重和能量的攝入量;(2)空腹血糖:檢測(cè)各組大鼠的空腹血糖;(3)隨機(jī)血糖:檢測(cè)各組大鼠的隨機(jī)血糖;(4)口服葡糖糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT):分別在手術(shù)前及術(shù)后第2、4、8、12、16周進(jìn)行檢測(cè);(5)胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin toler

4、ancetest，ITT):分別在手術(shù)前及術(shù)后第2、4、8、12、16周進(jìn)行檢測(cè);(6)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model of assessment for insulin resistance index，HOMA-IR)，采用計(jì)算公式HOMA-IR=空腹胰島素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5，分別于術(shù)前、術(shù)后2周、術(shù)后16周測(cè)定相應(yīng)數(shù)據(jù)并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。以胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)和胰島素抵

5、抗指數(shù)(HOMA-IR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來初步評(píng)估十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素敏感性的影響;(7)葡萄糖刺激的胰島素分泌:分別于術(shù)后第2、16周檢測(cè)血清胰島素水平。
　　結(jié)果：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)及腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素成功誘導(dǎo)出糖尿病大鼠模型，此模型具備胰島素抵抗（表現(xiàn)為AUCITT升高）及高血糖（開始時(shí)主要表現(xiàn)為隨機(jī)血糖升高明顯，其空腹血糖逐漸升高）的特點(diǎn)。
　　2.十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)與假手

6、術(shù)組(SHAM組)兩組大鼠的在體重和攝入能量方面，術(shù)前及術(shù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　3.術(shù)前，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)大鼠的空腹血糖與假手術(shù)組(SHAM組)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在術(shù)后第2、4、6、8、10、12、14、16周，DJB組大鼠的空腹血糖較SHAM組降低，P＜0.05，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明十二指腸空腸旁路術(shù)能夠明顯改善2型糖尿病大鼠的空腹血糖。
　　4.術(shù)前，十二指腸

7、空腸旁路手術(shù)組(DJB組)大鼠的隨機(jī)腹血糖與假手術(shù)組(SHAM組）相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在術(shù)后第1、2、4、6、8、10、12、14、16周，DJB組大鼠的隨機(jī)血糖較SHAM組降低，P＜0.05，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明十二指腸空腸旁路術(shù)能夠明顯改善2型糖尿病大鼠的隨機(jī)血糖。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了SD大鼠的糖尿病動(dòng)物模型并成功實(shí)施了十二指腸空腸旁路術(shù)及假手術(shù)，并證實(shí)了十二指腸空腸旁路術(shù)可以顯著地改善

8、2型糖尿病大鼠的糖代謝（空腹血糖、隨機(jī)血糖及糖耐量），且這種改善作用不依賴于術(shù)后體重的下降及進(jìn)食量的減少。
　　2.十二指腸空腸旁路術(shù)可以明顯改善2型糖尿病大鼠的胰島素敏感性，顯著緩解胰島素抵抗，但是在術(shù)后短期內(nèi)并不會(huì)明顯增加胰島素的分泌。
　　第二部分 十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)及相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　胰島素抵抗是2型糖尿病的一個(gè)重要特征，是指胰島素敏感靶器官對(duì)葡萄糖攝取、利用受損和肝臟葡

9、萄糖輸出增多。雖然胰島素抵抗具有明顯的特征性，但胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制仍不明確。近年來大量證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在導(dǎo)致胰島素抵抗過程中具有重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)重要的細(xì)胞器，用于協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)的合成，折疊和運(yùn)輸。附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的核糖體釋放新合成的肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其中的蛋白質(zhì)分子伴侶和折疊蛋白協(xié)助這些肽進(jìn)行正確翻譯后修飾和折疊。正確折疊的蛋白質(zhì)，被釋放到高爾基復(fù)合體進(jìn)行最終修飾，然后最終將它們送至最終目的地。如果蛋白質(zhì)合成過多或錯(cuò)誤

10、折疊的肽的流入超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累了大量未處理的蛋白質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3個(gè)跨膜信號(hào)分子:肌醇需求激酶-1(inositol-requiring enzyme-1，IRE-1)、雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白激酶(PKR-like ER protein kinase，PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)

11、，這些跨膜信號(hào)分子游離并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，觸發(fā)未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response，UPR)，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。以往的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過肌醇需求激酶-10RE-1)觸發(fā)c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminal kinase，JNK)通路的活性，JNK激活可使胰島素受體底物-1(insulinreceptor substrate-1，IRS-1)絲氨酸307位點(diǎn)(Ser307)發(fā)生磷酸化，

12、胰島素受體底物正常的酪氨酸磷酸化則受到抑制。一般情況下，胰島素與其受體的結(jié)合會(huì)引起胰島素受體構(gòu)型的變化，這種構(gòu)型的變化引起胰島素受體胞質(zhì)域特定酪氨酸殘基的磷酸化，進(jìn)而引起胰島素受體底物的聚集。酪氨酸磷酸化是胰島素受體底物激活和胰島素敏感性所必須的，這種作用可被胰島素受體底物絲氨酸磷酸化所阻滯，導(dǎo)致胰島素與胰島素受體結(jié)合下降，最終致胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。
　　十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)及相關(guān)信號(hào)通路的影響，目前還未見報(bào)道

13、。
　　目的：
　　本部分研究旨在探討十二指腸空腸旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)及與之相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以期進(jìn)一步闡明十二指腸空腸旁路術(shù)改善2型糖尿病大鼠糖代謝的內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：
　　各組存活的全部大鼠(DJB組14只、SHAM組13只、空白對(duì)照組10只)于術(shù)后16周處死，取各組大鼠肝臟組織應(yīng)用蛋白印記(Western blotting)技術(shù)對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè):(1)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)

14、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1的表達(dá)變化;(2)肝臟組織中總JNK蛋白、p-JNK蛋白的表達(dá)變化;(3)肝臟組織中IRS-1蛋白及p-IRS-1Ser307蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)與假手術(shù)組(SHAM組)兩組大鼠的肝臟組織均表達(dá)了磷酸化PERK蛋白(p-PERK); DJB組大鼠肝臟組織中磷酸化PERK蛋白(p-PERK)的相對(duì)表達(dá)量較SHAM組下降，P＜

15、0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)大鼠肝臟組織中IRE-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與假手術(shù)組(SHAM組)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但DJB組大鼠肝臟組織中磷酸化IRE-1蛋白(p-IRE-1)的相對(duì)表達(dá)量（即p-IRE-1/IRE-1的比值）較SHAM組下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)大鼠肝臟組織中總JNK蛋

16、白的相對(duì)表達(dá)量與假手術(shù)組(SHAM組)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但DJB組大鼠肝臟組織中磷酸化JNK蛋白(p-JNK)的相對(duì)表達(dá)量（即p-JNK/total JNK的比值）較SHAM組下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)大鼠肝臟組織中IRS-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與假手術(shù)組(SHAM組)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但DJB組大鼠肝臟組織中絲氨酸307位點(diǎn)磷

17、酸化的IRS-1蛋白(p-IRS-1Ser307)相對(duì)表達(dá)量（即p-IRS-1Ser307/IRS-1的比值）較SHAM組下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)與假手術(shù)組(SHAM組)兩組大鼠術(shù)后肝臟組織中均表達(dá)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白p-PERK，表明兩組大鼠均發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)較假手術(shù)組(SHAM組)大鼠

18、肝臟組織中PERK蛋白及IRE-1蛋白的磷酸化水平明顯下降，表明十二指腸空腸旁路術(shù)能夠顯著減少2型糖尿病大鼠肝臟組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解2型糖尿病大鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。
　　3.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)較假手術(shù)組(SHAM組)大鼠肝臟組織中JNK的磷酸化水平明顯下降，表明十二指腸空腸旁路術(shù)能夠顯著降低2型糖尿病大鼠JNK通路的活性。
　　4.術(shù)后16周，十二指腸空腸旁路手術(shù)組(DJB組)較假手術(shù)組(SHA