胃大彎折疊聯(lián)合十二指腸空腸旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠治療作用的探索.pdf

1、第一部分手術(shù)模型的建立與術(shù)式效果的評價
　　一、胃大彎折疊聯(lián)合十二指腸-空腸旁路手術(shù)模型的建立
　　[目的]建立肥胖型2型糖尿病大鼠模型，探索新型代謝手術(shù)GCP-DJB治療T2DM的可行性。
　　[方法]隨機選取經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)及小劑量STZ（30mg/kg）腹腔注射成功的T2DM大鼠模型22只，平衡組間體重差異后，分為:GCP-DJB組(n=12)、假手術(shù)Sham組(n=10)。測量術(shù)前、術(shù)后1周、2周、4周時的體

2、重，檢測空腹血糖、空腹血清胰島素(INS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)。
　　[結(jié)果]術(shù)前2組大鼠的各項指標(biāo)之間無差異(P＞0.05);術(shù)后1周時，與Sham組相比，GCP-DJB組的大鼠空腹血糖明顯下降(P＜0.05)，空腹胰島素水平升高(P＜0.05)，IRI開始下降(P＜0.05);術(shù)后2周至4周時，與Sham組相比，GCP-DJB組的大鼠體重明顯下降(P＜0.05)，空腹血糖明顯下降(P＜0.05)，空腹胰島素水平顯著升

3、高(P＜0.05)，胰島素抵抗指數(shù)IRI明顯降低(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]成功建立T2DM大鼠GCP-DJB手術(shù)模型，可為研究代謝手術(shù)治療糖尿病機制提供穩(wěn)定的動物模型。
　　一、GCP-DJB與SG對T2DM大鼠降糖效果相關(guān)代謝指標(biāo)的影響
　　[目的]研究比較GCP-DJB與常用的SG對T2DM大鼠的治療效果及代謝指標(biāo)差異。
　　[方法]將建模成功的T2DM大鼠，平衡體重差異后，隨機分成3組:Sham組(n

4、=6)、SG組(n=6)、GCP-DJB組(n=6)。檢測術(shù)前及術(shù)后2、4、6、8、10、12W體重及日均攝食量;并于術(shù)后12W行OGTT檢測糖耐量、胰島素釋放實驗，計算IRI;檢測餐后血清GLP-1、GIP、PYY、膽汁酸釋放曲線，計算AUC。
　　[結(jié)果]術(shù)前，3組大鼠體重、日均攝食量無顯著差異(P＞0.05)。術(shù)后12周時，SG組和GCP-DJB組體重、攝食量較Sham組更低(P＜0.05)，且GCP-DJB組較SG組更低(

5、P＜0.05); SG組及GCP-DJB組在糖耐量、餐后血清INS、GLP-1、PYY、膽汁酸方面較Sham組顯著提高(P＜0.05)，且除血清胰島素外，GCP-DJB組的糖代謝相關(guān)指標(biāo)較SG組更高(P＜0.05);SG組及GCP-DJB組IRI及GIP分泌較Sham組顯著下降(P＜0.05)，且GCP-DJB組GIP分泌量較SG組更低(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]GCP-DJB及SG均可作為治療T2DM的選擇術(shù)式之一，其緩解機

6、制可能與體重及攝食量的下降，INS、GLP-1、PYY、膽汁酸的升高，GIP及IRI的下降有關(guān)。從多種與T2DM降糖效果相關(guān)的代謝指標(biāo)來看，GCP-DJB術(shù)式的治療效果優(yōu)于SG。
　　第二部分減少LPS誘導(dǎo)的炎癥因子釋放是GCP-DJB緩解T2DM的內(nèi)在機制之一
　　一、高糖和LPS對SD大鼠胰腺β細(xì)胞胰島素分泌的影響
　　[目的]探索T2DM環(huán)境下高糖(HG)及LPS對SD大鼠胰腺β細(xì)胞胰島素分泌的影響。
　　

7、[方法]體外原代培養(yǎng)8周齡大鼠胰腺組織，根據(jù)析因分析設(shè)計為4組:C+LPS40(Glucose5mmol/ml+ LPS40pg/ml)，C+LPS200(Glucose5mmol/L+LPS200pg/ml),HG+ LPS40(Glucose25mmol/L+ LPS40pg/ml)，HG+LPS200(Glucose25mmol/L+LPS200pg/ml)。培養(yǎng)48h后，利用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測這4組培養(yǎng)

8、基內(nèi)胰島素mRNA表達(dá)，免疫熒光觀察比較HG和LPS對大鼠胰腺內(nèi)胰島素合成情況的差異。
　　[結(jié)果]HG和LPS均能顯著降低大鼠胰腺胰島素的表達(dá)量(P＜0.05)。HG能使胰腺中胰島素mRNA的表達(dá)下降39.58％(P＜0.05)，高LPS能使得使胰腺中胰島素mRNA的表達(dá)下降40.50％(P＜0.05)，兩種因素之間存在交互作用(P＜0.05)。
　　[結(jié)論] HG和LPS均能對胰腺β細(xì)胞造成損傷，顯著減少胰島素的合成與釋

9、放。LPS對胰島β細(xì)胞的損傷作用在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。
　　二、GCP-DJB對T2DM大鼠血清LPS及炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響
　　[目的]從LPS所誘導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)角度，探索GCP-DJB緩解T2DM的內(nèi)在機制。研究GCP-DJB術(shù)后T2DM大鼠血清LPS及炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的變化。
　　[方法]將20只T2DM大鼠隨機分為Control組(n=10)

10、和GCP-DJB組(n=10)。術(shù)前及術(shù)后12周時，ELISA檢測2組大鼠血清LPS、血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥相關(guān)指標(biāo)，HE光鏡及透射電鏡觀察胰腺內(nèi)外分泌部以及超微結(jié)構(gòu)變化，Q-PCR檢測胰腺胰島素mRNA表達(dá)水平，免疫組化及WB檢測胰島素蛋白表達(dá)量。組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。
　　[結(jié)果]術(shù)前2組大鼠LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥相關(guān)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

11、術(shù)后12周時，Control組大鼠胰腺外分泌部的腺細(xì)胞線粒體脫嵴腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，內(nèi)分泌部β細(xì)胞分泌顆粒數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫粒，線粒體減少;GCP-DJB組較Control組明顯改善。與Control組相比，GCP-DJB能顯著降低T2DM大鼠血清LPS(P＜0.05)及炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α(P＜0.05)，提高胰腺胰島素mRNA及蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]GCP-DJB能顯著改善T2DM

12、大鼠胰腺胰島素分泌功能，其內(nèi)在機制可能與降低LPS所誘導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。
　　第三部分探索GCP-DJB降低T2DM大鼠血清LPS的原因
　　一、GCP-DJB對T2DM大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　[目的]GCP-DJB能夠降低LPS所誘導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而提高胰島素儲備功能。因此，從LPS來源角度，探索GCP-DJB術(shù)后腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。
　　[方法]將10只同一批次2型糖尿病大鼠隨機分成2組:GCP-

13、DJB組(n=5)、Control組(n=5)。于術(shù)后12周時，處死大鼠采集盲腸內(nèi)容物樣本，進行16S rDNA測序（可變區(qū)V3+V4）。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計、優(yōu)化及相關(guān)多變量統(tǒng)計分析，對比2組大鼠細(xì)菌分類及豐度差異。
　　[結(jié)果]從多樣性指數(shù)來看，與Control組相比，GCP-DJB降低了總的細(xì)菌豐度，提高了某些特異菌群的比例。在門水平上，與Control組相比，GCP-DJB組厚壁菌門、軟壁菌門菌群比例顯著降低(P＜0.05);

14、擬桿菌門、黏膠球形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門顯著增高(P＜0.05); GCP-DJB組變形菌門雖較Control組高，但2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。從科水平上來看，與Control組相比，GCP-DJB組氨基酸球菌科、脫鐵桿菌科、Gastranaerophilales_norank、螺桿菌科、普雷沃氏菌科、紅螺菌科、黏膠球形菌科的群落豐度顯著增加(P＜0.05);芽胞桿菌科、梭菌科、腸球菌科、柔膜細(xì)菌科、支原體科、消化鏈

15、球菌科、瘤胃菌科的群落豐度顯著減少(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]GCP-DJB術(shù)后厚壁菌門、軟壁菌門菌群比例顯著降低，擬桿菌門、黏膠球形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門顯著增高，這些菌群結(jié)構(gòu)的變化可能與LPS的減少及T2DM的改善有關(guān)。
　　二、GCP-DJB對T2DM大鼠腸道黏膜屏障功能的影響
　　[目的]GCP-DJB能夠降低LPS所誘導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而提高胰島素儲備功能。因此，從LPS入血途徑角度，探索GCP-D

16、JB術(shù)后腸道黏膜屏障功能的變化。
　　[方法]將同一批次10只2型糖尿病大鼠隨機分成2組:GCP-DJB組(n=5)、Control組(n=5)。術(shù)后12周時，處死大鼠采集回腸組織標(biāo)本，HE、電鏡觀察腸道粘膜形態(tài)及腸道上皮緊密連接結(jié)構(gòu)，采用免疫組化、免疫熒光、WB檢測腸道粘膜上皮緊密連接結(jié)構(gòu)的閉合蛋白claudin-1、咬合蛋白occludin、和閉合小環(huán)ZO-1蛋白的表達(dá)量。
　　[結(jié)果]與Control組相比，GCP-D