磁標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠海馬齒狀回組織再生的實驗研究.pdf

1、背景和目的：腦外傷、腦出血和腦梗塞等腦損傷是人類致殘的主要原因,存在搶救存活后預(yù)后差,目前無特殊治療方法。本研究通過三個階段探討磁標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠海馬齒狀回組織再生的影響。
　　 1、羊膜組織來源的細(xì)胞通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀檢測、MTT法細(xì)胞活性檢測和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化等鑒定為問充質(zhì)干細(xì)胞,為超順磁性氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic iron oxidenanoparticles,SPION

2、s)標(biāo)記細(xì)胞的實驗研究提供干細(xì)胞來源。
　　 2、采用SPIONs單次和多次標(biāo)記法標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,探討SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的安全濃度,明確SPIONs安全濃度對羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響；通過磁共振檢測SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞在體外和體內(nèi)的信號存在和改變,為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療相關(guān)疾病的活體示蹤提供實踐基礎(chǔ)。
　　 3、SPIONs標(biāo)記的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植入缺血缺氧性腦損傷側(cè)腦皮質(zhì),

3、MRI示蹤干細(xì)胞移植后在宿主腦內(nèi)分布和遷移情況,實現(xiàn)活體的無創(chuàng)性和連續(xù)性動態(tài)監(jiān)測；通過免疫組織化學(xué)染色檢測海馬齒狀回組織的再生,探討干細(xì)胞在組織再生中扮演的角色。
　　 材料和方法:
　　 1.羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化酶消化和貼壁培養(yǎng)法獲取羊膜組織中細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀檢測、MTT法細(xì)胞活性檢測和神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化等鑒定羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。P3代生長狀態(tài)良好的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

4、于細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)細(xì)胞分三組。在1,2,4和7天分別進(jìn)行1、MTT法分析細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的細(xì)胞毒性；2、流式細(xì)胞儀分析間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面特異性分子的改變；3、RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色探討羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。
　　 2.SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外細(xì)胞磁共振成像SPIONs的濃度分別是3.5,7,14,and28μg／ml的細(xì)胞生長培養(yǎng)基(CytokineGrowth Medium,CGM

5、)或細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM)應(yīng)用于本研究。兩種SPIONs標(biāo)記法應(yīng)用于本研究:1、單次SPIONs標(biāo)記法:細(xì)胞培養(yǎng)首次(0d)更換的培養(yǎng)基含SPIONs,此后1d、2d和4d更換的培養(yǎng)基不含SPIONs；2、多次SPIONs標(biāo)記法:細(xì)胞培養(yǎng)首次(0d)更換的培養(yǎng)基含SPIONs,此后1d、2d和4d更換的培養(yǎng)基含SPIONs。根據(jù)和細(xì)胞培養(yǎng)基不同和SPIONs的標(biāo)記方法不同分為六組:1、細(xì)胞生長培養(yǎng)基組；2、細(xì)胞生長培養(yǎng)基+單次SPIO

6、Ns標(biāo)記組；3、細(xì)胞生長培養(yǎng)基+多次SPIONs標(biāo)記組；4、細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基組；5、細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基+單次SPIONs標(biāo)記組；6、細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基+多次SPIONs標(biāo)記組。
　　 細(xì)胞生長培養(yǎng)基(CGM)培養(yǎng)的細(xì)胞分別收獲于1、2、4和7d,各時間點獲得細(xì)胞分為三組分別行MTT法、普魯氏藍(lán)染色和流式細(xì)胞儀檢測；細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM)培養(yǎng)的細(xì)胞分別收獲于1、2、4和7d,各時間點獲得細(xì)胞分為三組分別行MTT法、普魯氏藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化

7、學(xué)染色、RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測；無SPIONs的細(xì)胞生長培養(yǎng)基組和細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基組作為對照組。
　　 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培育于SPIONs濃度分別為3.5μg／ml、7μg／ml、14μg／ml和28μg／ml的細(xì)胞生長培養(yǎng)基,共同孵育1天后消化、離心,懸于1.5ml1％瓊脂糖的Ependoff管,冷卻固化,SIEMEMS3.0 Trio Tim I—class MR掃描儀成像磁共振成像,完成SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

8、體外細(xì)胞磁共振成像。Wistar大鼠分組:1、14μg／ml SPIONs標(biāo)記的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞動物移植組,2、14μg／mlSPIONs動物移植組。移植細(xì)胞制備:14μg／ml SPIONs標(biāo)記的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(1天),1×106細(xì)胞混懸液5μl作為移植備用。細(xì)胞移植方法:健康Wistar大鼠腹腔麻醉,前囟前0.5mm、旁開3.0mm為中心鉆孔徑約為1mm的孔,緩慢注射至左側(cè)腦皮層(距離硬腦膜表面2mm)。對照組使用5μl14μg／

9、ml SPIONs的PBS液。移植后1天、1、4和7周行MRI檢查。14μg／mlSPIONs動物移植組方法同細(xì)胞移植方法,完成SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞磁共振成像。
　　 3.羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血缺氧性大鼠海馬組織再生的影響將7日齡新生大鼠共48只,隨機分成6組,各組8只:A組(假手術(shù)組):分離不結(jié)扎左側(cè)頸總動脈；B組(模型制備組):制備模型成功,不進(jìn)行細(xì)胞移植；C組(模型制備+損傷側(cè)PBS液移植組):制

10、備模型成功,移植5μl PBS液；D組(模型制備+損傷側(cè)SPIONs液移植組):制備模型成功,移植SPIONs5μl；E組(模型制備+損傷側(cè)干細(xì)胞移植組):制備模型成功,移植未經(jīng)SPIONs標(biāo)記的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞5μl；F組(模型制備+損傷側(cè)SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞移植組):制備模型成功,移植未經(jīng)SPIONs標(biāo)記的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞5μl；每組動物不同時間點(移植后1天、1周、4周和7周)分別進(jìn)行MRI檢查和腦組織海馬組織GFAP的免疫組織

11、化學(xué)染色。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備、移植、MRI監(jiān)測和免疫組織化學(xué)染色等方法雷同于前一階段研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.羊膜組織經(jīng)胰酶和膠原酶消化,獲取的細(xì)胞懸液原代接種于培養(yǎng)瓶。原代Po培養(yǎng)24小時,少量細(xì)胞貼壁；48小時,貼壁細(xì)胞數(shù)量增多；培養(yǎng)72小時,貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多；培養(yǎng)7天,貼壁細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底,接近50％～60％融合,貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣。P3-P10代細(xì)胞的生長曲線基本相同,P10代以后細(xì)胞活

12、力衰減。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測分析顯示:原代培養(yǎng)的P3代細(xì)胞,培養(yǎng)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基中其高表達(dá)膜表面分子CD29,CD44,CD90,CD105；陰性表達(dá)CD31,CD34,CD45和CD106。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。細(xì)胞形態(tài)改變顯示:培養(yǎng)7天,50-70％的細(xì)胞呈類似神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)并且細(xì)胞的細(xì)長突起交織成網(wǎng)。流式細(xì)胞儀檢測分析顯示:7天時陰性表達(dá)CD29,CD44,CD90和CD105。RT-PCR檢測分析顯

13、示:1天時Nestin表達(dá),2天時表達(dá)減少；4天時表達(dá)明顯減少；7天時無表達(dá)。1天時NSE無表達(dá),2天時開始表達(dá)；4天時表達(dá)增加；7天表達(dá)明顯增加。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)早期的細(xì)胞呈成纖維樣改變,Nestin染色陽性；誘導(dǎo)后期的細(xì)胞呈單極或多極改變,NSE染色陽性,細(xì)胞突起明顯,呈類似神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)；無GFAP染色細(xì)胞。
　　 2.不同SPIONs標(biāo)記方法標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞爬片經(jīng)普魯氏藍(lán)染色結(jié)果顯示:各組細(xì)胞S

14、PIONs標(biāo)記率均為100％,胞質(zhì)內(nèi)存在數(shù)量不等的藍(lán)染顆粒。MTT結(jié)果顯示明確小于和等于14μg／mlSPIONs是標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活性大于80％。單次SPIONs標(biāo)記法:同一時間的不同標(biāo)記濃度,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)染顆粒,隨標(biāo)記濃度增加,鐵顆粒呈簇狀聚集分布成堆。同一標(biāo)記濃度的不同時間,當(dāng)SPIONs濃度小于和等于14μg／ml,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)染顆粒聚集,隨標(biāo)記濃度時間延長,散布較前減少；當(dāng)SPIONs濃度大于14μg／ml細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)

15、染顆粒聚集前后無變化。多次SPIONs標(biāo)記法:同一時間的不同標(biāo)記濃度,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)小藍(lán)染顆粒散布,隨標(biāo)記濃度增加,鐵顆粒呈簇狀聚集分布成堆。同一標(biāo)記濃度的不同時間,當(dāng)SPIONs理論標(biāo)記濃度小于和等于14μg／ml,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)染顆粒聚集,隨標(biāo)記濃度次數(shù)增加和時間延長,呈聚集增加；當(dāng)SPIONs濃度大于14μg／ml細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)染顆粒聚集前后無變化。單次SPIONs標(biāo)記法:羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于含14μg／ml SPIONs的CGM,7

16、天羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面分子陽性表達(dá)CD29,CD44,CD90和CD105。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于含14μg／ml SPIONs的CIM,2天羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面分子明顯低表達(dá)CD29,CD44,CD90和CD105。Ependoff管內(nèi)SPIONs標(biāo)記細(xì)胞信號強度隨SPIONs標(biāo)記濃度的增高在SWI序列圖像依次降低,兩者存在高度線性相關(guān)。14μg／mlSPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞直接移植入正常大鼠腦皮層后,移植1天后仍可在SW

17、I序列圖像顯示為局限性極低信號,1周后低信號邊緣模糊,至7周后此低信號仍可在SWI序列圖像顯示。對照組14μg／ml SPIONs的PBS液在移植1周時低信號消失。
　　 3.新生大鼠腦缺血缺氧模型各組動物SWI序列圖像A組(假手術(shù)組),B組(模型制備組),C組(模型制備+損傷側(cè)PBS液移植組)和E組(模型制備+損傷側(cè)干細(xì)胞移植組)實驗動物在移植后1天、1周、4周和7周各個時間點的MRI檢查腦內(nèi)均未見異常信號。D組(模型制備+損

18、傷側(cè)SPIONs液移植組)實驗動物在移植后1天、1周、4周和7周各時間點的MRI檢查均可在SWI顯示缺血側(cè)額顳頂皮層注射區(qū)域異常低信號區(qū),且此異常高信號區(qū)域隨時間推移逐漸縮小。F組(模型制備+損傷側(cè)SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞移植組)實驗動物在不同時間點的MRI檢查,SWI序列圖像顯示缺血側(cè)額顳頂皮層異常低信號區(qū),隨移植后時間延長移植部位該低信號變化如下:移1天后,移植部位邊界清晰的類圓形低信號；移植1周后,移植部位類圓形低信號邊界略顯模糊較

19、1天時擴(kuò)大；移植4周后,移植部位類圓形低信號有線狀影沿胼胝體走行側(cè)腦室；移植7周后,移植部位類圓形和線狀影低信號邊界較較前明顯模糊。實驗各組動物的海馬結(jié)構(gòu)GFAP陽性細(xì)胞密度順序為齒狀回>CA3區(qū)>CA2區(qū)>CA1區(qū)。CA1區(qū)血管密度由高到低依次為:腔隙分子層、輻射層、多形層和錐體層。CA1、CA2區(qū)層次性最明顯,其中多形層毛細(xì)血管最豐富,錐體層最稀少:CA3區(qū)層次性稍差,齒狀回毛細(xì)血管以分子層最密集,顆粒層最稀少。A組(假手術(shù)組)實驗

20、動物在不同時間點的海馬組織GFAP陽性細(xì)胞呈高水平表達(dá),且排列密集；各時間點微血管的密度和直徑無統(tǒng)計學(xué)差異,P>0.05。B組(模型制備組)、C組(模型制備+損傷側(cè)PBS液移植組)和D組(模型制備+損傷側(cè)SPIONs液移植組)比較,組間各相同時間點的微血管的密度和直徑無統(tǒng)計學(xué)差異’P>0.05；各組實驗動物在1天時海馬組織GFAP陽性細(xì)胞呈低水平表達(dá),且排列稀疏,1周較1天時表達(dá)增高仍呈低水平表達(dá),有統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05；4周和7周

21、同1周比較無無統(tǒng)計學(xué)差異,P>0.05。E組(模型制備+損傷側(cè)干細(xì)胞移植組)F組(模型制備+損傷側(cè)SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞移植組)組間各相同時間點的微血管的密度和直徑無統(tǒng)計學(xué)差異,P>0.05。各組實驗動物在1天時海馬組織GFAP陽性細(xì)胞呈低水平表達(dá),且排列稀疏,1周較1天時表達(dá)增高仍呈中等水平表達(dá),有統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05；4周同1周比較表達(dá)增高仍呈中等水平表達(dá),有統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1.酶

22、消化貼壁培養(yǎng)法分離獲取細(xì)胞,成功鑒定羊膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力。
　　 2.應(yīng)用單次和多次SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,顯示濃度14μg／ml SPIONs是羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記的安全濃度且能夠在磁共振下顯像于體內(nèi)外,對其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的生物學(xué)特性無影響。
　　 3.SPIONs標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植于動物模型后動態(tài)磁共振成像能夠達(dá)到活體示蹤目的。
　　 4.羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞