視黃酸所致馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建及其形成的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:馬蹄腎是常見的先天性腎臟融合畸形，易合并多種并發(fā)癥。馬蹄腎形成的機(jī)制尚不明確，可能與組織細(xì)胞遷移能力下降、粘附能力增強(qiáng)相關(guān)。有研究表明經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與發(fā)育相關(guān)且參與細(xì)胞的遷移粘附，而視黃酸與受體結(jié)合后可以抑制經(jīng)典Wnt通路的核內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移、增強(qiáng)粘附作用，提示馬蹄腎形成的可能信號(hào)通路為:視黃酸及其受體（RA/RAR）—Wnt通路(Wnt5a/CaMKⅡ/TAK1/NLK)及核反應(yīng)元件(β-catenin/Lef/T

2、cf)—粘附Slug(Snai2)和遷移相關(guān)分子Rho(Rhob)—馬蹄腎。本研究的目的:①利用視黃酸建立馬蹄腎小鼠模型，為馬蹄腎發(fā)生機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。②對(duì)同窩馬蹄腎胎鼠及正常腎臟形態(tài)胎鼠的腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選可能與馬蹄腎發(fā)生相關(guān)的差異基因。③對(duì)篩選出的可能與馬蹄腎發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:①6-8周齡性成熟的ICR小鼠雌雄交配（雌∶雄=2∶1），以觀察到陰道栓為懷孕第1天(E1d)，在孕第8天(E8d)時(shí)給小鼠

3、腹腔內(nèi)注射視黃酸溶液，分別在E13d、E15d和E17d解剖孕鼠取出胎鼠，在體式顯微鏡下觀察胎鼠及其腎臟形態(tài)并拍照記錄。②取同窩E17d的馬蹄腎胎鼠2只(編號(hào)E17RA8、E17RA9)以及正常腎臟胎鼠2只（編號(hào)E17RA2、E17RA4），分別對(duì)其腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果質(zhì)控后進(jìn)行差異基因表達(dá)分析、差異基因表達(dá)模式聚類分析、差異基因GO功能以及Pathway富集分析等，篩選視黃酸及其受體參與的與腎臟發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路以及差異表

4、達(dá)基因中與遷移、粘附相關(guān)的分子及其信號(hào)通路。③對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因或可能信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，在馬蹄腎組織及受視黃酸刺激的胚腎細(xì)胞中進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證，探討視黃酸引起馬蹄腎的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:①馬蹄腎胎鼠尾巴長(zhǎng)度是正常腎臟胎鼠尾巴長(zhǎng)度的1/4-1/2。E13d解剖孕鼠1只，共有11只胎鼠，其中3只形成馬蹄腎，2只呈倒“八”字形，但不明確存在融合，6只腎臟形態(tài)正常。E15d解剖孕鼠1只，共有4只胎鼠，全部為馬蹄腎。E17d解剖

5、孕鼠2只，一只孕鼠有13只胎鼠，其中3只形成馬蹄腎，1只有形成趨勢(shì)，9只腎臟形態(tài)正常;另一只孕鼠有12只胎鼠，其中8只形成馬蹄腎，其余4只腎臟形態(tài)正常。②對(duì)同窩E17d的2只馬蹄腎胎鼠(編號(hào)E17RA8、E17RA9)及2只正常腎臟胎鼠(編號(hào)E17RA2、E17RA4)腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，正常和異常兩兩比較，篩選出差異1倍以上的基因，其中E17RA8與E17RA2比較有328個(gè)差異基因，E17RA8與E17RA4比較有802個(gè)差異基因

6、，E17RA9與E17RA2比較有562個(gè)差異基因，E17RA9與E17RA4比較有1061個(gè)差異基因;對(duì)以上4組進(jìn)行基因表達(dá)模式聚類分析共篩選出63個(gè)差異1倍以上的相同基因。查閱這63個(gè)基因的功能后并未找到與視黃酸及腎臟發(fā)育相關(guān)的基因，提示可能需擴(kuò)大篩選范圍。③利用馬蹄腎組織及正常腎組織對(duì)以上通路中的關(guān)鍵因子進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證，比較后結(jié)果顯示視黃酸受體Rarb、Wnt5a、核反應(yīng)元件Tcf3及粘附相關(guān)分子Snai2基因上調(diào)，而遷移相關(guān)