抑制GARFT建立小鼠NTDs動物模型及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　大量研究表明，神經(jīng)管畸形(NTDs)20％由遺傳因素造成,80%由非遺傳因素造成,但詳細(xì)機(jī)制尚未完全清楚。葉酸缺乏是導(dǎo)致NTDs發(fā)生重要病因之一，是近年來NTDs研究的最重要成果。大約50-70%的NTDs可通過適當(dāng)補(bǔ)充葉酸有效預(yù)防，因此，以葉酸為切入點(diǎn)，研究NTDs的具體發(fā)病機(jī)制對NTDs的防治有著重要的意義。
　　值得注意的是，迄今為止，未見通過單純飲食控制成功建立葉酸缺乏誘導(dǎo)的NTDs動物模型的報道，我們前

2、期根據(jù)葉酸缺乏是通過葉酸不同代謝途徑的代謝障礙間接導(dǎo)致NTDs及其他發(fā)育障礙的假設(shè)，阻斷葉酸相應(yīng)的葉酸代謝通路，成功制備了二氫葉酸還原酶、核苷酸還原酶、胸苷酸合成酶、甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)代謝途徑障礙NTDs小鼠系列動物模型，并證實以上關(guān)鍵酶所涉及的相關(guān)代謝通路障礙均可獨(dú)立引起NTDs的發(fā)生。為深入探索葉酸缺乏導(dǎo)致NTDs及出生發(fā)育障礙提供了模型基礎(chǔ)，通過不同模型的比較，可進(jìn)一步證實葉酸不同代謝途徑引起NTDs及出生缺陷的代謝機(jī)理。
　　

3、本文涉及的甘氨酰胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶（GARFT）也是葉酸實現(xiàn)其生物效應(yīng)的相關(guān)代謝通路關(guān)鍵酶之一，抑制其活性造成相關(guān)代謝障礙，是否可以誘發(fā)NTDs及其初步的分子機(jī)制是本文擬解決的科學(xué)問題。本科學(xué)問題的證實不僅對闡明葉酸的不同代謝途徑與NTDs及發(fā)育障礙的關(guān)系有著重要的意義，同時為在單純嘌呤單核苷酸代謝障礙的條件下進(jìn)一步研究NTDs及發(fā)育障礙的機(jī)制提供了重要模型基礎(chǔ)。該方面的研究尚未見報道。
　　目的：
　　1、采用甘氨酰

4、胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase， GARFT）特異性抑制劑洛美曲松(Lometrexol，dideazatetrahydrofolic acid，DDATHF）對懷孕小鼠進(jìn)行干預(yù)，誘導(dǎo)出嘌呤代謝異常的小鼠NTDs。
　　2、觀察DDATHF誘導(dǎo)的小鼠NTDs胚胎組織GARFT酶活性及嘌呤代謝的情況。
　　3、研究DDATHF干擾嘌呤從頭代謝

5、對小鼠NTDs胚胎組織細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
　　4、研究DDATHF誘導(dǎo)的GAR-FGAR代謝障礙小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
　　方法：
　　將19-21gC57BL/6J孕鼠隨機(jī)分組，實驗組于孕7.5（E7.5）天腹腔DDATHF給藥，生理鹽水為對照組。孕11.5（E11.5）天，取出胚胎，鏡下觀察胚胎神經(jīng)管及畸形的形態(tài)特征；利用組胚病理學(xué)方法進(jìn)一步觀察胚胎組織結(jié)構(gòu)畸變情況；用GARFT酶活性測定試劑盒和高效

6、液相色譜法在不同時間點(diǎn)（0h,6h,24h,48h,96h）測定胚胎組織的GARFT活性及ATP、GTP、dATP和dGTP的含量；通過免疫組化、實時熒光定量PCR及 Western-Blot的方法，分析DDATHF制備的NTDs凋亡及增殖的狀況。CCK-8，流式細(xì)胞法及慧星實驗進(jìn)一步分析DDATHF對小鼠D3胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
　　結(jié)果：
　　1、DDATHF成功誘導(dǎo)出小鼠NTDs，最佳劑量為45 mg/kg，N

7、TDs發(fā)生率為31.7%，小鼠NTDs主要表現(xiàn)后腦神經(jīng)管未閉，其它畸形主要為顱面畸形和發(fā)育遲緩，HE染色可見神經(jīng)管畸形胎鼠后腦泡未閉合。
　　2、GARFT活性檢測發(fā)現(xiàn)E7.5腹腔注射DDATHF后，胚胎組織中DDATHF活性約在6小時降到最低，在注射DDATHF96小時后，GARFT活性仍然低于正常水平。
　　3、HPLC結(jié)果顯示，DDATHF誘導(dǎo)的NTDs胚胎組織中ATP、GTP、dATP和dGTP的含量在腹腔注射DDA

8、THF后均逐漸降低，在注射DDATHF96小時后其含量仍低于正常水平。
　　4、采用免疫組化方法檢測Phospho-Histone H3（PH3）和Caspase-3（Casp-3）在胎鼠神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞的表達(dá)情況情況，PH3在NTDs組胚胎組織細(xì)胞的表達(dá)明顯低于對照組，Casp-3在NTDs組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多與對照組（P<0.05）。
　　5、Western-Blot檢測小鼠胚胎組織中PH3蛋白和Casp-3蛋白的表達(dá)

9、水平， PH3蛋白含量明顯低于對照組，Casp-3蛋白在NTDs組表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。
　　6、采用RT-PCR的方法檢測小鼠胚胎組織中Pcna，F(xiàn)oxg1，Ptch1，Apaf1，Casp-3和Casp-9的表達(dá)量，NTDs胚胎組織中Pcna，F(xiàn)oxg1和Ptch1的表達(dá)量顯著低于正常組，Apaf1，Casp-3和Casp-9的表達(dá)量在NTDs組明顯升高（P<0.05）。
　　7、CCK-8、Brdu流式細(xì)胞術(shù)

10、檢測DDATHF抑制D3鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)細(xì)胞增殖（P<0.05）。
　　8、AnnexinV/PI雙染法、線粒體膜電位法及慧星電泳實驗檢測DDATHF誘導(dǎo)ESC細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立DDATHF致C57BL/6J小鼠胚胎NTDs動物模型。
　　2、研究表明了嘌呤代謝異常與NTDs相關(guān)，為葉酸缺乏引起NTDs的機(jī)制研究作了重要補(bǔ)充。
　　3、DDATHF可引起胚胎組織細(xì)