山新楊響應木霉誘導的PdapARF1基因克隆及其過表達、RNAi轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建.pdf

1、木霉菌是一類重要的生防真菌，有些能通過分泌IAA等植物生長調(diào)節(jié)劑來促進植物生長。生長素在植物的整個生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而生長素響應因子（ARF）是調(diào)節(jié)生長素早期響應基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，在生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中起著關(guān)鍵性作用。為了深入研究木霉菌誘導下山新楊ARF轉(zhuǎn)錄因子對其生長及抗病的分子機制，本研究以山新楊葉片為材料，利用植物基因工程技術(shù)分別構(gòu)建PdapARF1基因過表達和RNAi表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化山新楊，獲得P

2、dapARF1過表達和沉默植株，主要研究結(jié)果如下：
　　1.以山新楊轉(zhuǎn)錄組文庫的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，成功克隆獲得了山新楊PdapARF1基因組DNA序列及cDNA序列，GenBank接收號分別為KP165071和KM113035.1。DNA序列全長5390 bp，包括14個外顯子和13個內(nèi)含子，cDNA序列全長1983 bp，編碼660個氨基酸。通過生物信息學分析，PdapARF1蛋白分子量為73.4 KDa，理論等電點為5.81，有Bf

3、iI_EcoRII_N_B3、Auxin_resp和AUX_IAA三個家族的保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對結(jié)果顯示山新楊PdapARF1氨基酸序列和其他植物的氨基酸序列相似性達到88％。將山新楊PdapARF1基因序列在毛果楊基因組上進行同源搜索，獲得了10個同源序列。通過SWISS-MODEL軟件預測獲得了PdapARF1蛋白DBD功能域的三級結(jié)構(gòu)。
　　2.采用qRT-PCR方法，研究在自然條件下，盆栽1年生山新楊組培移栽苗中Pdap

4、ARF1基因在木霉菌誘導下的差異表達。結(jié)果表明:分別采用棘孢木霉Ta536、Ta429和多株（等量混合的Ta536、Ta429、T650和T4）誘導山新楊，與對照相比，72h內(nèi)根和葉組織中PdapARF1基因均上調(diào)表達。并且多株木霉誘導下PdapARF1基因的上調(diào)表達量最大。
　　3.分別構(gòu)建了pROK2-ARF1過表達載體和pFGC-arf1s抑制表達載體。利用電擊法將兩種表達載體導入根癌農(nóng)桿菌中，并利用設計的兩對特異性引物進行

5、農(nóng)桿菌菌液PCR驗證，結(jié)果證明兩種載體均成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。
　　4.采用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的pROK2-ARF1和pFGC-arf1s表達載體分別轉(zhuǎn)入山新楊中，并進行抗性篩選培養(yǎng)，獲得了8株pROK2-ARF1抗性植株和32株pFGC-arf1s（6株pFGC-arf1B、8株pFGC-arf1R、12株pFGC-arf1BR和6株pFGC-arf1A）抗性植株。利用PCR技術(shù)對這些抗性植株進行驗證，最終獲得了1株pROK2-