慢病毒介導CCDC67轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學活性的鑒定.pdf

1、背景和目的：
　　甲狀腺癌是頭頸部的惡性腫瘤，是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中約占3％，在女性中發(fā)病率較高。甲狀腺癌中最常見的病理類型是乳頭狀癌，在甲狀腺癌中占約90%，其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢。雖然對甲狀腺癌變的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但其具體癌變機制仍需進行深層次地探索。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段、多基因改變的病理過程。基因突變、基因重組、癌基因的激活、表觀遺傳學的改變、抑癌基因的失活等在癌變過程中發(fā)揮重

2、要作用，而抑癌基因在轉(zhuǎn)錄水平和基因組的異常表達是腫瘤發(fā)生的常見原因之一。研究表明如果將失活的抑癌基因重新表達，恢復其功能，將會對腫瘤細胞的生長起到抑制作用。最近的研究表明卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域67（CCDC67）是一個新的候選抑癌基因，且與腫瘤形成的細胞信號傳導有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)CCDC67 mRNA在肺癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)其表達缺失或降低。但有關(guān)甲狀腺癌中CCDC67基因的表達及其臨床資料很少有報道。因此，我們運用RT-PCR檢測C

3、CDC67mRNA在甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma, PTC)中的表達情況，Western blot檢測CCDC67蛋白在PTC中的表達情況，并分析其與臨床病理的相關(guān)性。接著采用慢病毒介導穩(wěn)定轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細胞，使CCDC67在細胞中過表達，分析轉(zhuǎn)染前后甲狀腺乳頭狀癌細胞的生物活性，鑒定CCDC67的基因功能，以此評判CCDC67基因是否是PTC的抑癌基因，為腫瘤的治療提供新的契機。
　

4、　材料與方法：
　　1、采用RT-PCR及Western blot檢測56例PTC腫瘤組織及其與癌灶相隔2cm以上的非癌上皮（non-carcerous epithelium,NCE）組織中CCDC67基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯情況，并分析其與臨床病理的相關(guān)性。
　　2、運用RT-PCR、Western blot檢測甲狀腺癌細胞系TPC-1、SW579中CCDC67基因表達的情況。
　　3、CCDC67基因慢病毒表達載體的構(gòu)建及

5、鑒定。
　　4、構(gòu)建慢病毒載體介導CCDC67過表達TPC-1細胞，通過侵襲遷移實驗、平板克隆實驗、流式細胞技術(shù)檢測細胞周期、凋亡、CCK-8、劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染前后TPC-1細胞生物學活性。
　　5、采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩樣本率的比較用四格表資料的卡方檢驗，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩樣本定量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、56例癌旁組

6、織中均出現(xiàn)CCDC67mRNA和蛋白的表達。PTC組織中有41.4%（23/56）出現(xiàn)CCDC67mRNA的表達，與患者的TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），有46.4%（26/56）出現(xiàn)CCDC67蛋白的表達，且與患者的TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。
　　2、在甲狀腺癌細胞系中，TPC-1、SW579細胞中CCDC67的表達均缺失。3、PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明成功獲取CCDC67基因cD

7、NA克隆，測序結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒連接構(gòu)建正確。熒光表達檢測顯示293T細胞中產(chǎn)生慢病毒顆粒，Western blot顯示CCDC67在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，證實成功構(gòu)建CCDC67基因慢病毒表達載體。
　　4、通過慢病毒介導CCDC67過表達TPC-1細胞，轉(zhuǎn)染后TPC-1細胞的生物學活性受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1、在甲狀腺癌細胞系以及甲狀腺乳頭狀癌組織標本中均檢測到CCDC67基因mRNA以及蛋白表達的缺失，初步證