雙酚A和雌二醇對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖的影響和機制研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)是常見的內(nèi)分泌相關(guān)惡性腫瘤之一，也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率上升速度最快的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占80％以上。雖然PTC腫瘤被看作是生長緩慢的腫瘤，主要治療方式為甲狀腺的部分或完全切除，其次通過用放射性碘(131I，RAI)消除殘余甲狀腺癌細(xì)胞組織，這可治愈大多數(shù)TC患者。甲狀腺癌患者術(shù)后需要終身服用甲狀腺激素替代治療，約20-30％的患者發(fā)展為局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，特別是當(dāng)腫瘤

2、失分化并變的失去攝碘能力，以及原發(fā)灶很小就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，其死亡風(fēng)險大大增加。當(dāng)然，有一部分微小癌生長非常緩慢可能生長很多年未被發(fā)現(xiàn)。目前，甲狀腺癌的發(fā)病機制并不清楚，積極尋找致病原因及危險因素深入探討其發(fā)病機制對本病的防治至關(guān)重要。
　　已有研究表明雌激素對甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。課題組的前期研究也表明具有雌激素活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A也可以影響甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。但雌激素及雙酚A對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞遷移及細(xì)胞周

3、期有何影響？這種作用是通過何種受體及信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用的？二者的作用有無差異？這些問題是我們的興趣所在。研究提示雙酚A和雌二醇與甲狀腺癌的關(guān)系將為該病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 雙酚A和雌二醇對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力的影響
　　背景：
　　流行病學(xué)調(diào)查表明，甲狀腺乳頭狀癌的患病率在育齡期女性比同年齡段的男性高出3-4倍，表明甲狀腺癌的發(fā)生可能受到女性性激素，特別是雌激素的影響。甲狀腺腫瘤發(fā)病機制復(fù)

4、雜，常見原因可能與家族史、碘的攝入量，電離輻射以及BRAF，RET，NTRK等基因突變有關(guān)。而放射線暴露史和甲狀腺癌家族史，以及BRAF，RET/PTC和NTRK等常見的體細(xì)胞突變并不能解釋甲狀腺癌的發(fā)病的顯著性別差異，碘是甲狀腺激素合成重要原料，缺乏將會引起甲狀腺功能減退、智力低下、身材矮小。目前國際上普遍認(rèn)為，甲狀腺癌的病理類型與碘的攝入量無關(guān)，但也有研究顯示碘攝入量高的地區(qū)甲狀腺癌的發(fā)病率增高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌，本課題組前期動

5、物實驗研究也表明，高碘飲食可誘發(fā)大鼠甲狀腺組織發(fā)生乳頭狀甲狀腺癌，但這也并不能解釋女性甲狀腺癌患病人數(shù)的增多，而性激素參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生似乎是解釋顯著性別差異的合理假說。以前的研究已經(jīng)清楚地表明，雌激素可以影響癌細(xì)胞生長，由于在女性月經(jīng)周期，懷孕和哺乳期間，甲狀腺較長時間的暴露于較高的雌激素水平環(huán)境中，被認(rèn)為容易患甲狀腺癌。17β-雌二醇(E2)是人類中最有效的雌激素之一，并且對存在于良性和惡性甲狀腺細(xì)胞中的雌激素受體具有很高的

6、親和力。E2還促進(jìn)雌激素靶器官如乳腺和子宮內(nèi)膜組織的癌性病變。已有研究表明，乳腺癌患者中甲狀腺結(jié)節(jié)性腫大發(fā)生率較高，表明對于雌激素相關(guān)的器官，有一種共刺激生長因素參與了甲狀腺腫瘤的病理過程。
　　隨著社會的發(fā)展、環(huán)境污染的加重，環(huán)境因素對甲狀腺腫瘤的影響越來越受到人們關(guān)注。具有雌激素特性的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDCs)也可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。雙酚A(BPA)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的代表物，由聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的化合組成，存在于

7、塑料，農(nóng)藥，藥物，洗滌劑和化妝品等數(shù)千種消費品中。
　　目的:
　　1.檢測不同濃度的雙酚A和雌二醇對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)增殖活力的影響;
　　2.檢測最佳濃度的雙酚A和雌二醇對BHP10-3細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期的影響;
　　3.檢測雙酚A和雌二醇對BHP10-3細(xì)胞增殖的影響是否是基于雌激素核受體(ERα/ERβ)和膜受體(GPR30)的表達(dá)。
　　方法:
　　1.采用不同濃度的雙酚A

8、(10-3-10-8M)和雌二醇(10-4-10-9M)，干預(yù)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)，在不同時間點(24h、48h、72h)采用CCK-8實驗方法檢測BHP10-3細(xì)胞增殖活力，觀察細(xì)胞生長曲線，檢測BHP10-3細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)的變化，確定BPA和E2促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳濃度和時間。
　　2.采用細(xì)胞劃痕實驗判斷雙酚A和雌二醇對BHP10-3細(xì)胞遷移能力的影響。
　　3.利用最佳濃度的雙酚A和雌二醇干預(yù)BHP10

9、-3細(xì)胞，分別在不同時間點(24h、48h、72h)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞DNA含量及計算細(xì)胞增殖指數(shù)，分析BPA及E2對細(xì)胞周期相的影響;
　　4.采用免疫熒光法確定雌激素核受體(ERα/ERβ)和膜受體(GPR30)在人甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位;
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的BPA和E2刺激甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)，BPA和E2的促增殖作用表現(xiàn)為倒置的“U”型曲線，呈濃度和時間依

10、賴性，最佳增殖濃度分別為10-7M和10-8M，活細(xì)胞數(shù)隨著時間延長而增多;
　　2.細(xì)胞劃痕實驗顯示BHP10-3細(xì)胞在雙酚A和雌二醇的作用下，促進(jìn)其運動和遷移。
　　3.流式細(xì)胞細(xì)胞周期相顯示，雙酚A和雌二醇均可促進(jìn)BHP10-3細(xì)胞從G0/G1進(jìn)期展到S期，24h為G0/G1進(jìn)展到S期的最佳時間。
　　結(jié)論:
　　1.雙酚A具有顯著的雌激素活性，低劑量的雙酚A(BPA，10-7M)和雌二醇(E2，10-8M

11、)即可發(fā)揮其生物學(xué)活性，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移。
　　2.雌激素受體ERα、ERβ和GPR30共同表達(dá)于人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中，雙酚A和雌二醇一樣促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)的增殖可通過雌激素受體依賴性途徑。
　　第二部分 雙酚和雌二醇誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞產(chǎn)生mERα和GPR30及對AKT/mTOR通路的影響
　　背景:
　　PI3K/Akt通路在致癌過程中的作用已經(jīng)被廣泛的探

12、索和報道，最近的研究證實這一途徑與TC，尤其是與FTC和ATC的發(fā)病機制關(guān)系密切。關(guān)于PI3K/Akt/mTOR通路的激活有多重方式，越來越多的亞臨床或臨床數(shù)據(jù)支持這一途徑可能代表一種治療TC潛在目標(biāo)，而針對PI3K/Akt/mTOR的口服藥物已成功的治療多種惡性腫瘤，正逐漸被廣泛應(yīng)用。特別是當(dāng)甲狀腺腫瘤對傳統(tǒng)的放射性碘治療產(chǎn)生抵抗的時候，即難治性甲狀腺癌的治療，需努力去確定這些途徑中可能的治療目標(biāo)。研究表明雌激素促進(jìn)雌激素反應(yīng)性器官惡

13、性腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能是通過結(jié)合ERs而激活PI3K/Akt/mTOR通路的激活而致。由于甲狀腺乳頭狀癌顯著的性別差異，我們推測雌激素受體參與了其發(fā)病，而具體哪種受體參與PI3K/Akt/mTOR通路的激活尚不清楚。由于BPA在結(jié)構(gòu)上類似于E2，它是否也可通過雌激素受體依賴性途徑激活該通路仍有待確定。而運用單獨靶向或雙重受體抑制劑是否可抑制該通路的激活也是本文關(guān)注的重點。
　　目的:
　　1.檢測雙酚A(10-7M)和雌二醇(

14、10-8M)干預(yù)BHP10-3細(xì)胞后，BHP10-3細(xì)胞中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相關(guān)受體基因和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　2.明確PI3K/Akt/mTOR通路在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病中的作用，以及明確雙酚A是否類似于雌二醇可激活PI3K/Akt/mTOR通路。
　　3.了解選擇性雌激素受體拮抗劑ICI182，780和特異性GPR30拮抗劑G15是否可通過抑制雌激素受體的表達(dá)而阻斷BHP10-3細(xì)胞PI3K/Akt/m

15、TOR(PAM)通路的激活。
　　4.比較雙酚A和E2在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的作用差異。
　　方法:
　　1.通過Real-time PCR和Western blot實驗技術(shù)分別在24h和48h檢測雙酚A(BPA)和雌二醇(E2)干預(yù)后的人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相關(guān)受體基因和蛋白表達(dá)水平的變化;
　　2.通過Real-time PCR和Western blot實驗技術(shù)明

16、確選擇性或特異性雌激素受體拮抗劑ICI(10-6M)、G15（10-8M）預(yù)處理BHP 10-3細(xì)胞1h后，是否可抑制雌激素相關(guān)受體基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.運用Real-time PCR和Western blot實驗技術(shù)再次證實雙酚A(10-7M)和雌二醇(10-8M)可明顯增強ERα、ERβ和GPR30在BHP10-3細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.雙酚A(10-7M)和雌二醇（10-8M）均可迅速刺激甲狀腺

17、乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中Akt/mTOR發(fā)生磷酸化，最佳時間均為30分鐘。
　　結(jié)論:
　　1.Akt/mTOR信號通路參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長。
　　2.Akt/mTOR通路的激活可能是基于上游雌激素受體（mER和GPR30）的過表達(dá)而完成。
　　3.ICI可顯著抑制BPA和E2誘導(dǎo)的BHP10-3中ERα的表達(dá)，由于ERα和ERβ的不同作用特點，單獨應(yīng)用ICI，其拮抗作用表

18、現(xiàn)為不確定性。
　　4.G-15能顯著抑制E2誘導(dǎo)的雌激素受體及下游通路分子的表達(dá)，從而達(dá)到抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，但對于BPA無抑制作用;ICI和G15對于E2誘導(dǎo)的GPR30及下游通路分子的表達(dá)具有協(xié)同性。
　　5.BPA和E2類似于特異性激動劑G1的作用均可顯著促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖，二者之間比較無顯著性差異。
　　6.BPA可以通過基因組轉(zhuǎn)錄途徑或非基因組途徑促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腫瘤的進(jìn)展，但激活雌激素受體的方式