STARS在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細胞胰島素抵抗中的作用.pdf

1、隨著國民經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的提高，我國2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，而2型糖尿病合并的心腦眼腎等器官的慢性并發(fā)癥，往往導(dǎo)致其高死亡率和高致殘率，嚴重威脅人類健康。胰島素抵抗是2型糖尿病的重要的發(fā)病機制，但其具體機制尚不清楚，而高脂是誘發(fā)胰島素抵抗的重要危險因素。
　　Rho信號橫紋肌激活劑（thestriatedmuscleactivatorofRhosignalling，STARS）,它是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，在心肌，骨骼肌

2、和平滑肌特異性表達，主要與肌節(jié)的I蛋白和肌絲結(jié)合。近年來有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者以及糖耐量正常但有胰島素抵抗的一級親屬其骨骼肌中STARS表達增加并與胰島素敏感性呈負相關(guān)，而且高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠骨骼肌STARS表達也增加，并且能用胰島素增敏劑羅格列酮糾正。下調(diào)STARS表達后骨骼肌葡萄糖的攝入增加。這些都表明STARS可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)。
　　血漿反應(yīng)因子（Serumresponsefactor，SRF）是一個重要的細胞轉(zhuǎn)

3、錄調(diào)控因子，主要存在于3種組織-心肌、骨骼肌和平滑肌。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者以及糖耐量正常但有胰島素抵抗的一級親屬其骨骼肌SRF調(diào)節(jié)的基因表達增加，而且SRF抑制劑CCG-1423能夠改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的糖耐量。巨核細胞白血病因子1（megakaryoblasticleukemia1，MKL1）是一種單項調(diào)節(jié)的輔因子，也是STARS激活SRF的一個重要的輔助因子。SRF、MKL1是STARS的下游因子，在STARS的許多生物學(xué)作用中發(fā)

4、揮著重要作用。STARS是否通過MKL1或SRF進而導(dǎo)致胰島素抵抗尚不清楚。
　　本課題采用棕櫚酸孵育L6成肌細胞構(gòu)建胰島素抵抗模型，并通過質(zhì)粒上調(diào)和siRNA下調(diào)肌細胞中STARS的表達，研究STARS在骨骼肌胰島素抵抗中的作用以及其下游信號通路。
　　目的：研究STARS在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細胞胰島素抵抗中的作用及其機制。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化大鼠L6成肌細胞，將成肌細胞分化成骨骼肌細胞，并用棕櫚酸

5、（PA）孵育，建立胰島素抵抗模型。實驗分組如下，上調(diào)STARS表達的實驗分組：對照組（control），空質(zhì)粒組（pcDNA），STARS過表達組（pcDNA/STARS），棕櫚酸組（PA），棕櫚酸空質(zhì)粒組（PA+pcDNA），棕櫚酸STARS過表達組（PA+pcDNA/STARS）；下調(diào)STARS表達的實驗分組：對照組（control），siRNA陰性對照組（NC-siRNA），STARS敲低組（si-STARS），棕櫚酸組（PA），

6、棕櫚酸siRNA陰性對照組（PA+NC-siRNA），棕櫚酸STARS敲低組（PA+si-STARS）。通過RT-PCR及Western方法檢測STARSmRNA及蛋白表達水平，確定轉(zhuǎn)染成功后，用葡萄糖氧化酶法測定各組細胞的葡萄糖攝取率評價胰島素的敏感性。采用RT-PCR和Western-blot方法分別檢測SRF、MKL1，以及胰島素信號通路中AKT、IRS-1、及GLUT4的mRNA和蛋白表達水平，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣

7、本間比較采用t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1、L6成肌細胞成功分化
　　與未分化的L6成肌細胞相比，成功分化組標(biāo)志性基因Desmin和MyogeninmRNA的表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；
　　2、棕櫚酸干預(yù)后各指標(biāo)變化：PA組培養(yǎng)基中葡萄糖含量較control組明顯升高（18.01±1.03mmol/Lvs.13.13±0.70mmol/L），表明胰島素敏感性下降（P＜0.05）。與contr

8、ol組相比，PA組STARS基因表達明顯增加（P＜0.05），IRS-1、AKT、GLUT4基因表達均明顯下降（均P＜0.05），STARS、p-IRS-1（ser307）蛋白表達明顯增加（均P＜0.05），p-AKT、GLUT4蛋白表達均明顯下降（均P＜0.05）；
　　3、STARS上調(diào)后各指標(biāo)變化：與control相比，pcDNA/STARS組肌細胞STARS基因和蛋白表達均顯著增加；與PA組相比，PA+pcDNA/STAR

9、S組肌細胞STARS基因和蛋白表達均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。與control相比，pcDNA/STARS組肌細胞IRS-1、GLUT4和AKT基因表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），MKL1、SRF基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05），AKT、IRS-1總蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），p-IRS-1蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05），p-AKT和GLUT

10、4蛋白表達明顯下降（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA/STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平顯著增加和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達均顯著降低（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　4、STARS下調(diào)后各指標(biāo)的變

11、化：與control相比，si-STARS組肌細胞STARS基因和蛋白表達均顯著降低；與PA組相比，PA+si-STARS組肌細胞STARS基因和蛋白表達均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARSsiRNA轉(zhuǎn)染成功。與control相比，si-STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化（均P>0.05），但是p-IRS-1（

12、ser307）表達明顯降低和p-AKT、GLUT4蛋白表達明顯升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。與PA組相比，PA+si-STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平表達顯著降低和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達均顯著升高（均P＜0.05

13、），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高脂孵育可以導(dǎo)致骨骼肌細胞胰島素抵抗以及STARS表達增肌，同時伴有胰島素信號通路的變化。
　　2、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA調(diào)節(jié)STARS的表達，胰島素信號通路中AKT、IRS-1和GLUT4的表達也發(fā)生相應(yīng)變化。說明STARS與胰島素抵抗密切相關(guān)，為STARS作為一個新的胰島素抵抗或2型糖尿病的治療靶點提供了理論依據(jù)。

14、　　3、調(diào)節(jié)STARS的表達雖然并不能引起其下游靶點MKL1和SRF表達的變化，但是STARS可能通過影響其修飾后翻譯，也可能通過其他信號通路在胰島素抵抗中發(fā)揮作用，其具體分子機制需要進一步研究。（均P＞0.05），p-IRS-1蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05），p-AKT和GLUT4蛋白表達明顯下降（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA/STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

15、義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平顯著增加和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達均顯著降低（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　4、STARS下調(diào)后各指標(biāo)的變化：與control相比，si-STARS組肌細胞STARS基因和蛋白表達均顯著降低；與PA組相比，PA+si-STARS組肌細胞STARS基因和蛋白表

16、達均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARSsiRNA轉(zhuǎn)染成功。與control相比，si-STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化（均P>0.05），但是p-IRS-1（ser307）表達明顯降低和p-AKT、GLUT4蛋白表達明顯升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。與

17、PA組相比，PA+si-STARS組肌細胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平表達顯著降低和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達均顯著升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高脂孵育可以導(dǎo)致骨骼肌細胞胰島素抵抗以及STARS

18、表達增肌，同時伴有胰島素信號通路的變化。
　　2、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA調(diào)節(jié)STARS的表達，胰島素信號通路中AKT、IRS-1和GLUT4的表達也發(fā)生相應(yīng)變化。說明STARS與胰島素抵抗密切相關(guān)，為STARS作為一個新的胰島素抵抗或2型糖尿病的治療靶點提供了理論依據(jù)。
　　3、調(diào)節(jié)STARS的表達雖然并不能引起其下游靶點MKL1和SRF表達的變化，但是STARS可能通過影響其修飾后翻譯，也可能通過其他信號通路在胰島素抵