腸易激綜合征腸上皮-腸膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究分三個(gè)部分對(duì)以上問題進(jìn)行探討，第一部分研究IBS患者結(jié)腸BDNF過表達(dá)可能的起始機(jī)制，第二、三部分探討腸粘膜BDNF過表達(dá)介導(dǎo)IBS腹痛發(fā)生的分子機(jī)制，
　　方法：
　　第一部分依據(jù)功能性胃腸病羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)納入22例IBS-D患者和17例正常對(duì)照者，收集每位受試者新鮮糞便，經(jīng)處理后提取上清液(Fecal supernatants，F(xiàn)SN)，應(yīng)用azo-casein法測(cè)定上清液蛋白水解酶活力。應(yīng)用絲氨

2、酸蛋白酶抑制劑驗(yàn)證IBS-DFSN升高的蛋白酶活性依是否賴于絲氨酸蛋白酶。
　　FSN分別刺激6小時(shí)和24小時(shí)提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BDNF和PAR-2 mRNA表達(dá);同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，應(yīng)用ELISA測(cè)定上清BDNF濃度。
　　選用野生雄性C57BL/6小鼠，應(yīng)用IBS-D FSN結(jié)腸灌注誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸高敏感。
　　第二部分根據(jù)羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)入選IBS患者和正常對(duì)照者，每位IBS患者完成一份腸道功

3、能評(píng)分量表，進(jìn)行腹痛嚴(yán)重程度和頻率評(píng)分。收取IBS和正常對(duì)照者糞便，提取上清。
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)活檢標(biāo)本結(jié)腸粘膜中BDNF和GFAP表達(dá)，熒光雙標(biāo)檢測(cè)TrkB受體和P物質(zhì)在EGC和腸神經(jīng)纖維中的表達(dá)。
　　應(yīng)用透射電鏡觀察EGC形態(tài)學(xué)改變，并定量EGC中異染色質(zhì)，線粒體，糖原顆粒，高爾基體和核糖體數(shù)目的改變。
　　第三部分應(yīng)用IBS-D患者糞便上清以及BDNF+/-C57BL/6小鼠和同窩出生BDNF+/+野生

4、小鼠構(gòu)建模擬IBS的內(nèi)臟高敏感模型。收集灌注部位結(jié)腸組織，應(yīng)用western blotting和免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)腸粘膜BDNF，GFAP，TrkB和SP的表達(dá)。
　　應(yīng)用大鼠空腸腸系膜神經(jīng)放電實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGC培養(yǎng)液上清和r-HuBDNF對(duì)腸系膜傳入神經(jīng)興奮性放電和機(jī)械敏感性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證EGC激活和BDNF對(duì)腸道感覺傳入神經(jīng)興奮性和敏感性的直接作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.IBS-D

5、患者糞便上清液中絲氨酸蛋白酶活性明顯升高。
　　2.IBS-D患者糞便上清誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞BDNF mRNA和蛋白表達(dá)升高Caco-2細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)在IBS-D FSN刺激后顯著升高。而FUT-175預(yù)處理的IBS-D FSN組BDNF mRNA表達(dá)明顯受到抑制。與mRNA結(jié)果一致，ELISA檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)在IBS-D FSN刺激后同樣顯著升高，F(xiàn)UT-175則同樣明顯抑制IBS-D FSN對(duì)BDNF蛋白表達(dá)

6、的誘導(dǎo)作用。
　　3.PAR-2基因沉默顯著抑制IBS-D糞便上清對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　PAR-2受體在IBS-D FSN刺激后表達(dá)顯著高于對(duì)照FSN組，為進(jìn)一步探討PAR-2受體激活是否參與IBS-D FSN對(duì)BDNF表達(dá)的誘導(dǎo)過程，我們應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)RNA干擾瞬時(shí)沉默PAR-2基因在Caco-2的表達(dá)。結(jié)果顯示PAR-2基因沉默對(duì)Caco-2 BDNF的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯影響，但卻顯著抑制IBS-D

7、FSN對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF表達(dá)的上調(diào)作用。
　　4.p38 MAPK通路蛋白參與IBS-D糞便上清液誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞BDNF過表達(dá)
　　結(jié)果顯示IBS-D FSN能夠快速誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化增加，但對(duì)p65蛋白無明顯影響。PAR-2抑制劑ENMD-1068可阻斷IBS-D FSN對(duì)p38磷酸化的誘導(dǎo)。p38 MAPK抑制劑SB203580可阻斷IBS-DFSN對(duì)Caco-2細(xì)胞BDNF蛋白的上調(diào)，但NF-κB

8、抑制劑PDTC則無此作用。
　　5.結(jié)直腸灌注IBS-D糞便上清液可誘導(dǎo)C57小鼠結(jié)腸高敏感，其作用依賴于結(jié)腸PAR-2激活和BDNF的過表達(dá)
　　Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照FSN相比，結(jié)腸灌注IBS-D FSN可顯著上調(diào)小鼠結(jié)腸上皮BDNF蛋白的表達(dá)，且此作用可被FUT-175和ENMD-1068抑制。免疫組化驗(yàn)證了Western blotting結(jié)果，顯示上調(diào)的BDNF主要分布于結(jié)腸上皮和粘膜。

9、r>　　第二部分
　　1.研究對(duì)象基本情況
　　連續(xù)納入符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)的IBS患者30例和正常對(duì)照者30例。IBS患者腹痛程度和腹痛頻率評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，IBS亞型之間無明顯差異。IBS-D患者糞便上清(IBS-D FSN)絲氨酸蛋白酶活力為明顯高于正常對(duì)照(median(IQR)1521(905.3-1983) U/mg蛋白vs.465(264.3-708.0) U/mg蛋白; P＜0.0001）。絲氨酸蛋白酶抑制

10、劑抑肽酶(aprotinin)顯著降低IBS-D FSN絲氨酸蛋白酶活力(245(109.8-413.5) U/mg蛋白;P＜0.001）。而IBS-C FSN絲氨酸蛋白酶活力(455(253-905.5) U/mg蛋白）與對(duì)照無明顯差異。
　　2.BDNF及其受體TrkB與腸膠質(zhì)細(xì)胞(EGC)在腸粘膜分布緊密相關(guān)。
　　3.IBS患者結(jié)腸粘膜BDNF，TrkB，GFAP表達(dá)升高在本研究群體中，免疫組化和western bl

11、otting再次驗(yàn)證了IBS患者結(jié)腸BDNF表達(dá)顯著高于對(duì)照者，與我們之前發(fā)表另一IBS研究群體的研究結(jié)果一致。
　　4.IBS患者結(jié)腸腸膠質(zhì)細(xì)胞(EGC)伴有顯著的超微結(jié)構(gòu)改變
　　5.IBS患者結(jié)腸腸膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)P物質(zhì)升高
　　6.GFAP與SP表達(dá)與IBS腹痛評(píng)分顯著相關(guān)
　　第三部分
　　1.IBS-D FSN誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感小鼠結(jié)腸過表達(dá)BDNF，GFAP, TrkB和SP
　　選利用第二部

12、分研究中收集的IBS-D FSN進(jìn)行小鼠結(jié)腸灌注成功建立小鼠內(nèi)臟高敏感模型后，檢測(cè)結(jié)腸BDNF，TrkB和GFAP蛋白表達(dá)。Western blotting發(fā)現(xiàn)模型組小鼠BDNF，GFAP和TrkB蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照FSN組和抑肽酶預(yù)處理的IBS-D FSN組。免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)模型組和對(duì)照組結(jié)腸粘膜總SP和EGC特異表達(dá)的SP的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照FSN組和抑肽酶預(yù)處理的IBS-DFSN組。
　　2.BDNF基因敲除抑制

13、IBS-D FSN對(duì)小鼠內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo)作用
　　3.BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN對(duì)小鼠結(jié)腸BDNF，GFAP，TrkB和SP表達(dá)的上調(diào)
　　4.氟代檸檬酸誘導(dǎo)的腸膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙抑制IBS-D FSN對(duì)內(nèi)臟高敏感的誘導(dǎo)及SP的表達(dá)
　　5.重組人BDNF(r-HuBDNF)體外通過TrkB-PLCγ1通路直接激活腸膠質(zhì)細(xì)胞
　　6.r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清而非r-HuBDNF本身可誘導(dǎo)腸

14、系膜感覺傳入神經(jīng)的放電反應(yīng)
　　7.r-HuBDNF能夠增強(qiáng)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性，且此作用可被激活的EGC協(xié)同性增強(qiáng)
　　最后，我們進(jìn)一步探討r-HuBDNF及其激活的EGC對(duì)腸系膜神經(jīng)機(jī)械敏感性的作用。r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)大鼠空腸腸系膜神經(jīng)的機(jī)械敏感性增強(qiáng)作用最明顯，r-HuBDNF能夠中等程度的增加腸系膜神經(jīng)的機(jī)械敏感性，但幅度小于r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清。應(yīng)用TrkB拮抗劑預(yù)處理

15、腸系膜神經(jīng)可部分抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)機(jī)械敏感性的增強(qiáng)作用，而應(yīng)用TrkB拮抗劑和NK1拮抗劑共同預(yù)處理腸系膜神經(jīng)則可顯著抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對(duì)機(jī)械敏感性的增強(qiáng)作用。綜上，我們的研究結(jié)果表明盡管r-HuBDNF自身不能直接誘發(fā)腸系膜神經(jīng)放電，卻能夠誘導(dǎo)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性增加。激活的EGC也能夠通過釋放包括SP在內(nèi)的神經(jīng)興奮性物質(zhì)顯著增加腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性，因此我們認(rèn)為r-HuB

16、DNF和激活的EGC對(duì)腸系膜傳入神經(jīng)的機(jī)械敏感性具有協(xié)同性增加作用。
　　結(jié)論:
　　第一部分
　　1.IBS-D糞便上清對(duì)腸上皮細(xì)胞BDNF的基因表達(dá)具有顯著促進(jìn)作用，并通過PAR-2-p38 MAPK信號(hào)通路激活腸上皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)，且此作用依賴于糞便上清中升高的絲氨酸蛋白酶活性。
　　2.IBS-D糞便上清可體內(nèi)誘導(dǎo)結(jié)腸高敏感，且此過程依賴于結(jié)腸上皮PAR-2受體的激活和BDNF表達(dá)增高。
　　第

17、二部分
　　1.IBS患者結(jié)腸粘膜EGC可能存在激活，表現(xiàn)為GFAP表達(dá)增加以及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)SP的表達(dá)增多。
　　2.IBS患者結(jié)腸粘膜BDNF，EGC以及傳入神經(jīng)末梢密切相關(guān)，可能存在相互作用的增強(qiáng)。
　　3.BDNF及其相關(guān)的EGC改變與IBS患者腹痛癥狀具有正相關(guān)性。
　　第三部分
　　1.結(jié)腸BDNF過表達(dá)可增強(qiáng)腸感覺傳入神經(jīng)的化學(xué)和機(jī)械敏感性，但本身不能誘發(fā)神經(jīng)興奮性放電。
　　2.結(jié)腸B