GCS通過(guò)影響B(tài)CL-2的表達(dá)介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥.pdf

1、背景與目的：
　　在現(xiàn)階段，化療依然是治療終末期腫瘤的主要手段，而腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成是導(dǎo)致化療失敗的直接原因，導(dǎo)致預(yù)后不良。多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細(xì)胞在對(duì)某一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對(duì)其他化學(xué)作用原理不同、結(jié)構(gòu)各異的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。神經(jīng)酰胺在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡方面起著重要作用，而葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（GCS）可以催化神經(jīng)酰胺糖基化生成葡萄糖神經(jīng)酰胺（GlcCer），從而可以逃避神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的腫瘤凋亡。越

2、來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶水平升高有著密切的關(guān)系。細(xì)胞中ERK蛋白的高表達(dá)可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，作用于細(xì)胞凋亡的下游共同通路，發(fā)揮抗凋亡作用，Bcl-2的抗凋亡作用已被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的形成，有文獻(xiàn)報(bào)道，白血病耐藥細(xì)胞中存在GCS與Bcl-2的共同高表達(dá)[1]。但目前GCS與Bcl-2的關(guān)系及作用機(jī)制在結(jié)直腸癌中報(bào)道甚少。
　　本研究旨在通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌敏感株細(xì)胞H

3、CT-8、耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR及加入GCS抑制劑PPMP后，各組細(xì)胞中GCS、Bcl-2及ERK的表達(dá)情況，探討其相互關(guān)系及可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1細(xì)胞株的培養(yǎng)
　　1）HCT-8組：結(jié)腸癌敏感細(xì)胞HCT-8在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL)中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度。至少培養(yǎng)2周后，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4、r>　　2）HCT-8/VCR組：結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR在含1.0μg/ml VCR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以維持其耐藥性。實(shí)驗(yàn)在脫藥培養(yǎng)2周，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行。
　　3）HCT-8/VCR+PPMP組：HCT-8/VCR細(xì)胞株脫藥培養(yǎng)后，繼續(xù)在含有20μmol/L PPMP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-

5、8/VCR+PPMP組細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞GCS、Bcl-2及ERK蛋白的表達(dá)情況。
　　3熒光定量PCR法（RT-qPCR）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組的細(xì)胞，提取RNA，RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞GCS、Bcl-2及ERK基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1．結(jié)腸癌敏感細(xì)胞HCT-8及耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR中均有GCS和抗凋

6、亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)，耐藥細(xì)胞株中 GCS的表達(dá)高于敏感細(xì)胞株，差異顯著（P＜0.05）；并且Bcl-2在耐藥株中的表達(dá)也明顯高于敏感株細(xì)胞（P＜0.05），與GCS具有一致性。
　　2．HCT-8/VCR組與 HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入 GCS抑制劑 PPMP后，明顯抑制了 GCS的表達(dá)（P＜0.05）；同時(shí)，在 HCT-8/VCR+PPMP組抗凋亡蛋白Bcl-2與ERK蛋白的表達(dá)較HCT-8/VCR組下降（P

7、＜0.05）。
　　3．RT-qPCR檢測(cè)HCT-8/VCR組與HCT-8組目的基因，結(jié)果顯示：耐藥組細(xì)胞中GCS、Bcl-2及ERK基因都高于其親本細(xì)胞組，且差異顯著（P＜0.05）。
　　4．HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入抑制劑組的細(xì)胞內(nèi)GCS mRNA的表達(dá)量明顯低于HCT-8/VCR組（P＜0.05）；加入抑制劑PPMP后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和ERK基因的表達(dá)也較耐藥細(xì)胞組明顯下調(diào)（P＜