腺病毒介導(dǎo)的Bcl-XL shRNA治療結(jié)腸癌的研究.pdf

1、【背景和目的】腫瘤細(xì)胞的凋亡主要由死亡受體途徑(外源性)和，或線粒體途徑(內(nèi)源性)介導(dǎo)。來自死亡受體的信號能夠通過Bcl-2家族而與線粒體途徑交聯(lián)，進(jìn)而造成細(xì)胞色素C的釋放，并啟動凋亡體信號放大系統(tǒng)，因此在這一過程中Bcl-2家族處于非常關(guān)鍵的地位，其成員蛋白表達(dá)的失衡將導(dǎo)致凋亡信號通路的障礙，比如高表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-XL將導(dǎo)致多藥耐藥的細(xì)胞表型，而增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)則能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前越來越多的證據(jù)表明，Bc

2、l-2家族中抗調(diào)亡蛋白，促凋亡蛋白的值可能是一個提示腫瘤細(xì)胞是否抵抗凋亡的良好指標(biāo)。在結(jié)腸癌中BcI-XL是Bcl-2家族中表達(dá)最高的抗凋亡蛋白。最近我們利用RNA干擾技術(shù)，應(yīng)用人工合成的siRNA下調(diào)BcI-XL蛋白表達(dá)后，有效地誘導(dǎo)了獲得性5-Fu耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它還能夠逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對TRA/L基因的耐藥，這些結(jié)果初步提示針對Bcl-XL的RNA干擾在結(jié)腸癌治療中可能存在著較高的應(yīng)用價(jià)值。但是在實(shí)際操

3、作中RNA干擾作為一種生物治療手段，它的治療效果直接受到siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性、siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織特異性以及siRNA在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。近年來隨著研究地深入，人們發(fā)現(xiàn)運(yùn)用DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)shRNA能增加siRNA的穩(wěn)定性，但是在DNA質(zhì)粒應(yīng)用過程中仍存在轉(zhuǎn)染效率低下的問題。因此迫切需要一種更加有效的方法來體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA。先前的經(jīng)驗(yàn)告訴我們腺病毒能夠在腫瘤細(xì)胞中高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因，因此我們擬在本研究中選用重組腺病毒作為運(yùn)送

4、載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)BcI-XL shRNA以期達(dá)到殺滅結(jié)腸癌細(xì)胞的目的。 【方法】：首先構(gòu)建、重組和純化腺病毒Ad／BcI-XL shRNA，然后通過RT—PCR、MTT分析、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、Westem blot免疫印跡以及動物實(shí)驗(yàn)等方法來驗(yàn)證Ad／Bcl-XL shRNA對Bcl-XL的下調(diào)作用及其在體內(nèi)外的抗腫瘤效果。 【結(jié)果】：我們成功構(gòu)建和純化了重組腺病毒Ad／Bcl-XL shRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示500MOl的Ad

5、／BcI-XLshRNA即能在mRNA水平和蛋白水平顯著下調(diào)Bcl—XL的表達(dá)。接著我們發(fā)現(xiàn)感染72h后Ad／BcI-XL shRNA明顯抑制了人結(jié)腸癌DLDl和Lovo細(xì)胞的生長(p<0.05)，該抑制作用具有劑量和時間依賴關(guān)系，而對照載體Ad／GFP則對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長無明顯影響。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示AdlBd-XL shRNA作用14天后明顯抑制了DLD1細(xì)胞的克隆形成(p<0.05)，該抑制作用同樣也具有劑量依賴關(guān)系。接著

6、Western blot免疫印跡結(jié)果顯示Ad／BcI-XL shRNA能有效激活結(jié)腸癌細(xì)胞中的凋亡信號分子，包括caspase-9、caspase-3和PARP。同時我們也發(fā)現(xiàn)Ad／BcI-XL shRNA對NHFB無明顯毒性作用，這可能與NHFB中BcloXL表達(dá)低下有關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示Ad／Bcl-XL shRNA能有效抑制DLD1細(xì)胞來源的裸鼠皮下腫瘤的生長，并且反復(fù)多次瘤內(nèi)注射Ad／BcI-XL shRNA不會造成重要臟器的明

7、顯病理學(xué)損害。最后我們通過22例結(jié)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本的直接接種，成功建立起3例結(jié)腸癌臨床標(biāo)本來源的原代腫瘤動物模型，模型構(gòu)建的成功率為13.6％。AdlBcI-XLshRNA在這3例原代腫瘤模型中均能顯著抑制原代腫瘤的生長，并明顯延長荷瘤裸鼠的生存時間(p<0.05)。 【結(jié)論】：1)成功構(gòu)建和純化了重組腺病毒Ad／BcI-XL shRNA；2)證實(shí)Ad／BcI-XL shRNA能有效地下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中BcI-XL的表達(dá)，包括mR