腦脊液改良抗酸染色法的建立與臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)，是由結(jié)核分枝桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，是結(jié)核病中最嚴(yán)重的類型之一，如不及時治療其破壞性和預(yù)后非常差，所以早期診斷和及時治療對于降低發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要。結(jié)核性腦膜炎的診斷最為困難，往往和病毒性腦膜炎、細(xì)菌性腦膜炎、腦膜癌相混淆，很不容易分辨清楚，結(jié)核性腦膜炎的診斷以發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌或者以培養(yǎng)出結(jié)核桿菌作為“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]但是因為腦脊液標(biāo)本量少，而涂片傳統(tǒng)抗

2、酸染色和結(jié)核菌培養(yǎng)需要大量的腦脊液標(biāo)本，往往對結(jié)核桿菌的檢出率非常低，傳統(tǒng)抗酸染色有報道檢出率在10％以內(nèi)[2-3]傳統(tǒng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)法羅氏法(Lowenstein-Jensen)需要時間長，大約在4-6周才會檢測出結(jié)核桿菌的生長[4]，雖然現(xiàn)在有先進(jìn)的BD液體快速培養(yǎng)技術(shù)，但是也往往需要2-3周才會觀察到結(jié)核桿菌生長[21]，這樣往往會耽誤病情診斷及后續(xù)治療。血清學(xué)方法比較方便，但是缺乏敏感性和特異性，往往作為輔助診斷[5]。近年來，D

3、NA技術(shù)以及其他快速培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得檢測結(jié)核桿菌的時間大大縮短，但由于價格昂貴，不適用于在臨床廣泛使用。本研究旨在探尋一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的臨床檢測方法便于推廣普查結(jié)核性腦膜炎的臨床檢測方法，鑒于抗酸染色是結(jié)核桿菌感染的最佳診斷方法但其對結(jié)腦患者CSF檢出率低，不適用于TBM的普查診斷。因此本研究欲將在傳統(tǒng)抗酸染色的基礎(chǔ)上建立的改良抗酸染色法和目前臨床實驗室針對腦結(jié)核病進(jìn)行的多種診斷方法（包括濃縮集菌抗酸染色，傳統(tǒng)抗酸染色，腦脊液AD

4、A檢測，實時熒光定量PCR技術(shù)等）做一個平行比較以及分析在病情發(fā)展過程中相互之間的關(guān)系，以了解其在TBM診斷中的陽性率，突出改良抗酸染色在對結(jié)腦的診斷中陽性率高，準(zhǔn)確，操作簡便，快速等優(yōu)點，為改良抗酸染色在臨床TBM的篩查提供理論依據(jù)。
　　方法:1、收集河北省胸科醫(yī)院2014年1月-2014年10月結(jié)核內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科疑似結(jié)核性腦膜炎的64位患者腦脊液216份標(biāo)本（每位患者采集不低于3份標(biāo)本且間隔時間都不低于一周），患者都是從14

5、年1月開始新入院。
　　2、指標(biāo)檢測:對采集的64位疑似結(jié)核性腦膜炎的患者共216份標(biāo)本進(jìn)行了改良抗酸染色檢查。這216份標(biāo)本還分別進(jìn)行了腦脊液常規(guī)檢查、腦脊液濃縮集菌抗酸染色檢查、腦脊液普通涂片染色檢查、腦脊液生化檢查（項目包括腦脊液葡萄糖測定、腦脊液Cl離子測定、腦脊液蛋白測定、腦脊液ADA測定）、腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查（在入院第一或第二天就進(jìn)行了腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)，有27例患者進(jìn)行了FQ-PCR檢測）。
　　3、指標(biāo)分析:將改

6、良抗酸染色結(jié)果與其他各項常規(guī)檢查結(jié)果進(jìn)行對比，比較檢出率差異，綜合患者各項臨床指標(biāo)，最后確診是否為結(jié)核性腦膜炎
　　4、統(tǒng)計分析:采用卡方檢驗比較檢出率有無差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1、實驗結(jié)束后，調(diào)閱臨床資料:這64例患者中經(jīng)過診斷性治療，未用抗結(jié)核治療臨床病情好轉(zhuǎn)的有31例，其中確診隱球菌感染3例即腦脊液墨汁染色發(fā)現(xiàn)新生隱球菌，腦膜癌4例即經(jīng)病理診斷發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，懷疑是肺癌腦轉(zhuǎn)移;24例是病毒性腦

7、膜炎或細(xì)菌性腦膜炎，且未經(jīng)過抗結(jié)核治療病情明顯好轉(zhuǎn)。此課題中病例組33例，陰性對照組31例。
　　2、與目前臨床實驗室常用的結(jié)核菌檢測技術(shù)相比改良抗酸染色提高了結(jié)核性腦膜炎患者CSF中結(jié)核桿菌的陽性率，縮短了檢查時間，當(dāng)天就可得到結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌形態(tài)觀察:光學(xué)顯微鏡下，淡藍(lán)色背景，呈現(xiàn)紅色桿狀，細(xì)長，部分略微彎曲，偶見成堆分布呈柵欄樣的桿菌，以胞外菌居多，偶見胞內(nèi)菌。
　　3、結(jié)腦組有27例患者進(jìn)行腦脊液FQ-PCR，檢測

8、出分支桿菌DNA有23例為陽性。改良抗酸染色對33例患者第一次送檢的腦脊液進(jìn)行改良抗酸染色有29例檢出抗酸桿菌，兩種方法檢出率相比較，P＞0.05，兩種方法對結(jié)核桿菌的檢出率比較不具有統(tǒng)計學(xué)差別。
　　4、腦脊液改良抗酸染色與傳統(tǒng)抗酸染色對腦脊液中結(jié)核桿菌檢出率的比較，病例組107例改良抗酸染色中陽性例數(shù)65份，陽性率60.75％，傳統(tǒng)抗酸染色陽性例數(shù)6份，陽性率5.61％。所以改良抗酸對腦脊液中結(jié)核桿菌的檢出率比傳統(tǒng)抗酸染色檢出

9、率高，兩種方法比較P＜0.005，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、腦脊液細(xì)胞數(shù)與改良抗酸之間的關(guān)系，病例組107份標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在腦脊液細(xì)胞計數(shù)中白細(xì)胞數(shù)達(dá)到100以上有42份，改良抗酸染色發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌26份，陽性率61.9％;白細(xì)胞計數(shù)小于100的有65份，改良抗酸染色39份是陽性，率是60％。兩組陽性率比較P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6、腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法與腦脊液改良抗酸染色法的比較:病例組107份改良抗酸染色中陽性例數(shù)65

10、份，陽性率60.75％，腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法陽性標(biāo)本僅3份，陽性率僅2.8％。所以改良抗酸染色法比腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法檢出率高，兩種方法比較P＜0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7、腦脊液改良抗酸染色法與腦脊液細(xì)胞學(xué)之間的關(guān)系，這64例疑似顱內(nèi)感染的患者，初期送檢的腦脊液細(xì)胞學(xué)分析中，多分葉核中性粒細(xì)胞占百分比多在60％以上，并且在隨著治療的過程的進(jìn)行，分葉核中性粒細(xì)胞比重呈現(xiàn)進(jìn)行性下降，激活單核細(xì)胞，和淋巴細(xì)胞比例上升。針對這6

11、4例疑似患者多次平行腦脊液細(xì)胞學(xué)分析和改良抗酸染色分析。分葉核中性粒細(xì)胞占比大的發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌27例，并且細(xì)胞數(shù)隨治療時間的延續(xù)呈進(jìn)行性減少。所以腦脊液細(xì)胞學(xué)分析中性分葉核細(xì)胞居多的標(biāo)本，結(jié)核桿菌陽性率明顯高于淋巴細(xì)胞比例高的標(biāo)本。兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　8、腦脊液改良抗酸染色與腦脊液生化中ADA活性檢查的對比:腺苷脫氨酶（ADA）在結(jié)核性腦膜炎初期時活性會顯著增高，此課題在216份腦脊液分析中分別進(jìn)行了ADA檢測和改良抗酸染

12、色，以ADA活性水平4U/L為界限，ADA顯著增高的有78份標(biāo)本，其中用改良抗酸染色法檢測出結(jié)核菌陽性標(biāo)本為59份，陽性率75.6％。其余138份腦脊液標(biāo)本中ADA活性＜4U/L，有6份檢出抗酸桿菌，檢出率4.34％。兩種方法比較P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　9、腦脊液改良抗酸染色法與濃縮集菌法對結(jié)核菌檢出率的比較:病例組初次送檢33份標(biāo)本改良抗酸法陽性有29份，陽性率87.8％，濃縮集菌法33份標(biāo)本中陽性有6份，陽性率18.

13、2％，兩種方法陽性率的比較P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　10、改良抗酸染色法改良抗酸染色法陽性率與治療前后的關(guān)系:33份腦脊液抗結(jié)核療前行改良抗酸染色與74份腦脊液抗結(jié)核治療后再次行改良抗酸染色，進(jìn)行比較，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、改良抗酸染色相較于傳統(tǒng)抗酸染色1改良抗酸染色相較于傳統(tǒng)抗酸染色，濃縮集菌抗酸染色法及結(jié)核桿菌培養(yǎng)等明顯提高了腦脊液抗酸桿菌的檢出率，操作步驟簡單。對臨床快速準(zhǔn)確診

14、斷結(jié)核性腦膜炎具有非常高的應(yīng)用價值，可以作為臨床對結(jié)核性腦膜炎的最佳初篩試驗。
　　2、針對同一結(jié)核性腦膜炎患者CSF標(biāo)本，中性分葉核居多的腦脊液標(biāo)本陽性率率明顯高于非中性分葉核細(xì)胞比例居多的腦脊液標(biāo)本。腦脊液中細(xì)胞類型的變化可用于神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病情觀察指標(biāo)。
　　3、腦脊液ADA的檢測可作為結(jié)核性腦膜炎的早期輔助診斷、觀察病情和療效的常規(guī)檢查項目。
　　4、腦脊液改良抗酸染色與實時熒光定量PCR相比較，兩者對腦