梅毒螺旋體粘附素Tp0751重組菌影制備與免疫活性的初步研究.pdf

1、[目的]構(gòu)建重組梅毒螺旋體(Tp)黏附素 Tp0751的大腸埃希菌菌影(EBG)(rTp0751-EBG)，檢測(cè)其免疫活性，為深入探討其在抗Tp感染中的潛在免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。
　　[方法](1)EBG的制備與鑒定：將含有噬菌體PHiX174裂解基因E的質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化入E. coliDH5α，溫控誘導(dǎo)使其形成BG并計(jì)算裂解效率，瓊脂糖DNA電泳和透射電鏡(TEM)鑒定。(2)膜錨定載體的構(gòu)建與表達(dá)：PCR擴(kuò)增膜錨定基因E'(

2、含linker)，與pET28a-Tp0751構(gòu)建膜錨定載體pET28a-E'-Tp0751，轉(zhuǎn)化E. coliBL21誘導(dǎo)表達(dá)，WB鑒定E'-Tp0751的表達(dá)。(3) rTp0751-EBG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將含裂解基因盒E-box的pHH43與pET-32a質(zhì)粒酶切、連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET32a-E-box，再將其pET28a-E'-Tp0751構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-E'-Tp0751-E-box。(4)rTp075

3、1-EBG表達(dá)與鑒定：將pET28a-E'-Tp0751-E-box轉(zhuǎn)化E. coli BL21，28℃誘導(dǎo)表達(dá)Tp0751，升溫至42℃熱誘導(dǎo)裂解，計(jì)算裂解率。WB鑒定 Tp0751的表達(dá)；TEM鑒定 BG。(5)動(dòng)物免疫：分別用rTp0751-EBG肌注、rTp0751-EBG鼻滴、rTp0751肌注(加弗氏佐劑)、EBG肌注及PBS肌注途徑免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液，末次免疫后

4、第10d制備小鼠脾細(xì)胞。(6)rTp0751-EBG免疫活性測(cè)定：用間接ELISA法檢測(cè)血清特異性抗體IgG抗體及生殖道灌洗液中sIgA抗體水平，CCK-8法檢測(cè)rTp0751刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，間接ELISA檢測(cè)IFN-γ表達(dá)水平。
　　[結(jié)果](1)EBG制備與鑒定：42℃下pHH43上E基因被激活導(dǎo)致E. coli裂解形成BG，裂解率可達(dá)98.13％；瓊脂糖凝膠電泳未觀察到DNA條帶，TEM顯示絕大部分細(xì)菌都裂解成空泡狀

5、并保持細(xì)菌基本形態(tài)。(2)膜錨定載體的構(gòu)建與表達(dá)：PCR擴(kuò)增出大小約為180 bp左右的片段，與膜錨定基因 E'一致；SDS-PAGE顯示一分子量約28 KDa的可溶性蛋白，WB顯示該蛋白僅與 Tp感染兔血清反應(yīng)。(3)rTp0751-EBG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定：酶切及測(cè)序結(jié)果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)28℃誘導(dǎo)表達(dá)一分子量約28 KDa大小的明顯條帶，WB顯示其僅與Tp感染兔血清反應(yīng)

6、。在42℃誘導(dǎo)重組BG的OD600值開(kāi)始下降，裂解率為96.37%。TEM鑒定結(jié)果與EBG結(jié)果類(lèi)似。(4)rTp0751-EBG誘導(dǎo)系統(tǒng)和黏膜體液免疫應(yīng)答水平：rTp0751-EBG肌注組、rTp0751-EBG鼻滴組和rTp0751肌注組小鼠血清特異性IgG水平隨免疫次數(shù)增加而增加，第4周達(dá)到最大值，抗體效價(jià)均高于1︰25600，明顯高于PBS和EBG肌注對(duì)照組(P<0.01)，但前三組間無(wú)明顯差異。rTp0751-EBG肌注和鼻滴組

7、的小鼠生殖道黏膜分泌液中sIgA水平隨免疫次數(shù)增加而增加，于免疫后第四周達(dá)到最高，抗體效價(jià)均為1︰6400，高于rTp0751肌注組、PBS和EBG肌注組(P<0.05)，但前兩組間差異無(wú)顯著性。(5)rTp0751-EBG誘導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平：rTp0751-EBG肌注組、rTp0751-EBG鼻滴組、rTp0751肌注組的刺激指數(shù)(SI)均顯著高于EBG和PBS肌注組(P<0.01)，但前三組間無(wú)明顯差異。rTp0751-EBG