梅毒螺旋體Tp0463蛋白的表達(dá)及其在臨床血清學(xué)診斷中應(yīng)用的初步評價.pdf

1、目的：通過基因工程技術(shù)，表達(dá)梅毒螺旋體（Tp）重組蛋白Tp0463，探討其在梅毒臨床血清學(xué)診斷中的價值，為發(fā)現(xiàn) Tp新的候選診斷抗原提供實驗依據(jù)。
　　方法：從Genbank獲取Tp0463蛋白的基因序列，以Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株的全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增該基因編碼第8-110號氨基酸的基因片段；將目的基因克隆入T-A克隆載體pMD18-T中，再亞克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/

2、Tp0463，經(jīng)PCR、雙酶切與測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，SDS-PAGE分析目的產(chǎn)物的表達(dá)形式，用Ni-NTA親和層析法純化目的重組蛋白，SDS-PAGE分析純化蛋白的純度，BCA法測定純化蛋白濃度；Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性（抗原性）和特異性。以純化重組蛋白TP0463包被微孔板，建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，檢測標(biāo)準(zhǔn)梅毒陽性血清、陰性血清

3、共40份，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件；以優(yōu)化的ELISA檢測體系隨機(jī)檢測臨床診斷明確的梅毒患者血清150份、健康人血清份150份、易發(fā)生交叉反應(yīng)的人群（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)核病患者及孕婦）血清40份，與金標(biāo)準(zhǔn)梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）進(jìn)行平行比較，初步評價重組抗原Tp0463在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。
　　結(jié)果： PCR擴(kuò)增出一大小約330bp的目的片段（含引物），重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序（測序結(jié)果

4、與GenBank登錄序列完全一致）鑒定證實插入片段為目的基因Tp0463；SDS-PAGE分析顯示，構(gòu)建的pET28a(+)/Tp0463原核重組表達(dá)菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了一相對分子量約為16kDa的重組蛋白，在宿主菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性方式存在，經(jīng)Ni-NTA親和純化后，純度在95％以上；Western-blot結(jié)果顯示目的蛋白僅能與標(biāo)準(zhǔn)梅毒陽性混合血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與非梅毒混合血清反應(yīng)。以重組蛋白為已知抗原建立間接ELISA

5、法，檢測標(biāo)準(zhǔn)梅毒陽性和陰性血清，其陽、陰性符合率分別為95.45%和100%，總符合率為97.5%；對340份臨床標(biāo)本隨機(jī)進(jìn)行檢測，與金標(biāo)準(zhǔn)TPPA法比較，建立的ELISA法的總靈敏度為88.7%，低于TPPA法，特異度為100%，兩種方法的總符合率為95.0%。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建 Tp0463原核表達(dá)重組質(zhì)粒，在宿主菌內(nèi)誘導(dǎo)高效表達(dá)重組目的蛋白，該蛋白有良好的免疫反應(yīng)性。
　　2.與金標(biāo)準(zhǔn) TPPA方法相