白藜蘆醇對(duì)膿毒癥相關(guān)性腦病小鼠海馬的保護(hù)作用.pdf

1、目的：膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)是膿毒癥患者常見的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，癥狀輕可譫妄，嚴(yán)重者昏迷，與膿毒癥患者死亡率密切相關(guān)。SAE引起的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能改變是主要的神經(jīng)損傷之一，且與膿毒癥癥狀的嚴(yán)重程度并無相關(guān)性，對(duì)患者遠(yuǎn)期的生活質(zhì)量影響較大。既往研究中指出，海馬的炎性損傷是造成遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制之一，其中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的

2、促炎作用十分重要，因此，針對(duì)IL-1β生成的干預(yù)措施可能對(duì)SAE治療和預(yù)后有益。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然的Sirt1激動(dòng)劑，其自身也具有多種生物活性。在膿毒癥的動(dòng)物模型相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了白藜蘆醇可提高膿毒癥動(dòng)物模型的生存率，對(duì)膿毒癥引起的腎、肺等其他臟器功能衰竭具有治療和保護(hù)作用，機(jī)制可能與減輕IL-1β造成的炎性損傷相關(guān)。本研究擬通過經(jīng)典盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation andpuncture，C

3、LP)法復(fù)制膿毒癥小鼠模型，研究白藜蘆醇對(duì)SAE小鼠海馬炎性損傷的保護(hù)作用，并通過在體模型和體外BV2細(xì)胞培養(yǎng)初步探討白藜蘆醇對(duì)SAE小鼠海馬炎性損傷保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1、白藜蘆醇對(duì)SAE小鼠海馬炎性損傷的保護(hù)作用(1)將野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為CLP組、假手術(shù)組（Sham組）、高劑量白藜蘆醇組（Res1組）和低劑量白藜蘆醇組(Res2)，白藜蘆醇組分別于術(shù)前1h、術(shù)后6h、術(shù)后12h和術(shù)后18h腹腔

4、內(nèi)注射不同劑量白藜蘆醇，CLP組和Sham組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔內(nèi)注射二甲基亞砜(dimethy sulfoxide，DMSO)。術(shù)后第4天開始，連續(xù)四天行隱蔽站臺(tái)實(shí)驗(yàn);第7天行空間探索實(shí)驗(yàn)。記錄各組水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris WaterMazing，MWM)結(jié)果并統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)指標(biāo)。
　　(2)將野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為CLP組、假手術(shù)組（Sham組）、高劑量白藜蘆醇組（Res1組）和低劑量白藜蘆醇組(Res2)，白藜蘆醇組分別

5、于術(shù)前1h、術(shù)后6h、術(shù)后12h和術(shù)后18h腹腔內(nèi)注射不同劑量白藜蘆醇，CLP組和sham組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔內(nèi)注射DMSO。術(shù)后24 h觀察并比較不同組小鼠海馬細(xì)胞凋亡情況和免疫組織化學(xué)染色特點(diǎn)，利用免疫熒光雙染色定位白藜蘆醇的潛在作用靶點(diǎn)。
　　2、白藜蘆醇對(duì)SAE小鼠海馬炎性損傷保護(hù)作用的機(jī)制(1)將野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為CLP組、假手術(shù)組（Sham組）、高劑量白藜蘆醇組（Res1組）和低劑量白藜蘆醇組(Res2組)

6、，每組6只，白藜蘆醇組腹腔內(nèi)注射不同劑量白藜蘆醇，CLP組和Sham組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔內(nèi)注射DMSO。術(shù)后24 h比較不同組小鼠海馬相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平。
　　(2)利用BV2細(xì)胞建立小膠質(zhì)細(xì)胞刺激模型，分為對(duì)照組（Con組）、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激組（LPS組）、高濃度白藜蘆醇處理組（Res3組）和低濃度白藜蘆醇處理組（Res4組），培養(yǎng)24 h后比較不同組BV2細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)

7、指標(biāo)mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平。
　　(3)利用BV2細(xì)胞建立小膠質(zhì)細(xì)胞刺激模型，分為對(duì)照組（Con組）、LPS刺激組（LPS組）、白藜蘆醇處理（Res3組）和尼克酰胺(nicotinamide，NAM)處理組(NAM組)，培養(yǎng)24 h后比較不同組BV2細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、隱蔽站臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與Sham組(45.26±16.24)相比，CLP組(58.70±5.58)小鼠從訓(xùn)練第2天開始潛伏

8、期延長(zhǎng)（P＜0.05）;笫4天實(shí)驗(yàn)中，Res1組（29.77±13.13）與Res2組（44.77±17.99）潛伏期都較CLP組（57.29±8.15）縮短（P均小于0.05），與Sham組（27.28±13.19）相比，Res2組潛伏期長(zhǎng)于Sham組(P＜0.05)，而Res1組則無顯著差異。空間探索實(shí)驗(yàn)，與Sham組(2.67±0.82)相比，CLP組(0.17±0.41)和Res2組(2.17±0.75)穿臺(tái)率較低（P均小于0.

9、01），目標(biāo)象限時(shí)間短(Sham組 vsCLP組，Res2組:41.89±7.53 vs6.47±4.63，23.17±4.96，P均小于0.01)，而Res1組穿臺(tái)率（1.00±0.63）高于CLP組和Res2組，目標(biāo)象限時(shí)間長(zhǎng)（16.35±6.19，P均小于0.01）。
　　2、CLP組小鼠海馬細(xì)胞凋亡數(shù)目（17.00±1.00）顯著多于Sham組（1.67±0.58）和Res1組(4.00±1.00，P均小于0.01)，Re

10、s1組和Res2組(9.67±0.58)小鼠海馬細(xì)胞凋亡數(shù)目也具有顯著差異(P＜0.01)。與Sham組相比，CLP組（CLP組vs Sham組:1.33±0.58 vs15.33±0.58）小鼠IL-1β含量升高，小膠質(zhì)細(xì)胞激活(Sham組vs CLP組:1.00±0.00 vs16.33±1.53)增多，結(jié)果具有顯著差異（P均小于0.01），白藜蘆醇可減少IL-1β的數(shù)量和小膠質(zhì)細(xì)胞激活（P均小于0.01）。免疫雙熒光染色顯示IL-

11、1β生成（Sham組vs CLP組:1464.99±196.25 vs6056.27±239.73）與小膠質(zhì)細(xì)胞激活（Sham組vs CLP組:1180.10±167.76 vs5810.60±337.42）相關(guān)，Res1組二者熒光強(qiáng)度為2048.41±104.60和1770.88±90.53，Res2組二者熒光強(qiáng)度為4405.97±207.80和3132.35±178.51，與CLP組有差異。(P均小于0.01)3、在體模型實(shí)驗(yàn)中，R

12、es1組與Res2組小鼠Sirt1 mRNA（Res1組vs Res2組:11.58±3.45 vs5.62±1.17）含量較Sham組和CLP組（Sham組vs CLP組:1.00±0.00 vs3.37±0.24）小鼠顯著增加（P均小于0.05）;與CLP組小鼠相比，Res1組和Res2組小鼠IL-1β及NALP3的mRNA含量(Res1組，Res2組vs CLP組:2.15±0.93，4.29±1.14vs9.46±1.35，1.

13、57±0.22，2.77±0.60vs6.26±2.42)和蛋白含量(Res1組，Res2組vs CLP組:1.96±0.07，2.94±0.09 vs4.02±0.05;1.32±0.05，2.10±0.10 vs2.84±0.07)都顯著減少（P均小于0.05），Iba1蛋白(Res1組，Res2組vs CLP組:1.65±0.10，2.32±0.26 vs3.72±0.04)含量亦明顯減少(P均小于0.05)，兩組相比，Res1組

14、變化較Res2組更顯著(P均小于0.05)。
　　4、體外BV2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Res3組與Res4組SIRT1 mRNA水平（Res3組 vs Res4組:6.43±0.95 vs3.58±0.51）較Con組和LPS組顯著升高(Con組vs LPS組:1.00±0.00vs1.69±0.17,P均小于0.01)，LPS組NALP3和IL-1β mRNA水平分別是:16.25±4.30和10.64±2.29，Res3組二者mRNA水

15、平分別是1.68±0.29和1.76±0.30，Res4組為6.67±0.65和5.31±1.91，與LPS組相比表達(dá)水平都顯著降低（P均小于0.01）;Res3組和Res4組NALP3的蛋白表達(dá)水平分別為1.13±0.05和2.06±0.09,與LPS組3.08±0.09相比顯著降低（P均小于0.01），半胱天冬酶-1(caspase-1)（Res3組，Res4組vs LPS組:1.92±0.14，2.59±0.15vs3.76±0.

16、24）和IL-1β蛋白（Res3組，Res4組vsLPS組:2.43±0.31，3.79±0.04vs1.05±0.07）表達(dá)水平降低（P均小于0.01），影響與濃度相關(guān)（P＜0.05）。
　　5、體外BV2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，NAM組NALP3（2.23±0.10）、caspase-1（2.23±0.10）和IL-1β（4.16±0.05）蛋白表達(dá)水平較Res3組（1.18±0.03;2.20±0.13;2.12±0.08）升高(P均小