六元雜環(huán)類除草劑的高效檢測及毒物代謝動力學(xué)研究.pdf

1、前言:
　　六元雜環(huán)類除草劑在本研究中定義為聯(lián)吡啶類除草劑和均三嗪類除草劑。其中百草枯毒性最強，每年因誤服或投毒導(dǎo)致死亡的案件高達(dá)上千例。敵草快與百草枯同屬聯(lián)吡啶類除草劑，攝入后對生物體的還原-氧化活性影響很大，對人體肺、心、肝、腎等都有毒害，并且能導(dǎo)致胎兒畸形。撲草凈是均三嗪類除草劑，與乙草胺常聯(lián)合使用，雖然其毒性較小，但易殘留，尤其地表水易受污染。長期暴露于撲草凈和乙草胺能導(dǎo)致生物體產(chǎn)生氧化自由基損傷，產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫

2、，進而影響超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶功能異常，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、線粒體受損、DNA損傷，進一步導(dǎo)致糖代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝紊亂。這三種除草劑也可定義為內(nèi)分泌干擾素，因為它們對人體或生物體造成傷害的原因均是基于其進入機體后產(chǎn)生氧化自由基損傷，自由基使生物體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥自由基等活性氧，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織損壞而引發(fā)疾病。本文從法醫(yī)毒物分析和環(huán)境化學(xué)分析角度，建立以百草枯為代表的六元雜環(huán)類除草劑在生物樣品和水

3、中殘留檢測方法并初步研究其在動物體內(nèi)的毒物代謝情況。
　　方法:
　　對于百草枯和敵草快在生物樣品和環(huán)境中的檢測，采用氯化鎳催化和硼氫化鈉還原生物樣品和水樣品中的百草枯和敵草快，而后用固相微萃取方法進行提取，最后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀監(jiān)測。本研究對百草枯和敵草快的衍生化條件和固相微萃取條件進行了優(yōu)化。
　　對于撲草凈和乙草胺在血漿中的檢測，采用超聲萃取方法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，同時研究撲乙合劑在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

4、及過程，對超聲萃取方法條件進行了優(yōu)化。
　　結(jié)果:
　　對于百草枯生物樣品中的分析，加入20mg NaBH4在pH13強堿性環(huán)境中反應(yīng)10min被確定為最優(yōu)化衍生化條件;20％NaCl溶液于60℃反應(yīng)20min被確定為最優(yōu)化固相微萃取條件。進而考察了百草枯在0.1～50μg/mL濃度范圍的線性關(guān)系，包括精密度實驗、回收率實驗、穩(wěn)定性實驗、基質(zhì)效應(yīng)等方法學(xué)考察，最后用該方法進行了百草枯毒物代謝動力學(xué)的初步研究。血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的線

5、性方程為Y=0.01096X+0.0871，r=0.9982;尿標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=0.0957X-0.0163，r=0.9987。血漿和尿中百草枯的檢測限LOD為0.01μg/mL，LOQ為0.05μg/mL。實驗結(jié)果表明:百草枯血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液中，日內(nèi)精密度(n=3)為1.82％～8.43％，日間精密度(n=5)為8.60％～10.9％;百草枯尿標(biāo)準(zhǔn)溶液中，日內(nèi)精密度(n=3)為0.72％～4.19％，日間精密度(n=5)為5.39

6、％～10.49％。在空白血漿樣品和空白尿樣品中采用添加法計算回收率，回收率范圍在94％～100.3％?；|(zhì)效應(yīng)對于實驗結(jié)果無影響。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示50μg/mL百草枯的血漿樣品溶液和尿樣品溶液在3個凍融循環(huán)后和在-20℃保存14天的RSD分別小于6.08％和5.04％，以及6.79％和2.73％。百草枯在家兔體內(nèi)的毒物代謝動力學(xué)參數(shù):t1/2為82h，Cmax為13.65μg/mL,AUC0-∝為217μg·h/mL。
　　對于

7、百草枯和敵草快水樣品中的分析，加入100mgNaBH4在pH9的弱堿性環(huán)境中于90℃反應(yīng)20min被確定為最優(yōu)化衍生化條件。加入10％NaCl溶液于60℃平衡萃取20min被確定為最優(yōu)化固相微萃取條件?？疾炝税俨菘莺蛿巢菘煸?.5～500ng/mL的線性關(guān)系，敵草快、百草枯在水樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0769X+0.2748，r2=0.999; Y=0.0957X-0.0163，r2=0.9987。向空白水中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，在高(50

8、0ng/mL)、中（200ng/mL）、低(1ng/mL)三個濃度考察回收率和日間、日內(nèi)精密度，回收率范圍91.2％～100.3％，日內(nèi)精密度在1.2％～6.2％，日間精密度在1.1％～6.3％?；|(zhì)效應(yīng)對于實驗結(jié)果無影響。本研究發(fā)現(xiàn)百草枯的還原產(chǎn)物為4，4'-二甲基聯(lián)哌啶;敵草快的還原產(chǎn)物為1，1'-乙基-2，2'-聯(lián)哌啶。本研究首次發(fā)現(xiàn)1，1'-乙基-2，2'-聯(lián)哌啶存在順式和反式兩種構(gòu)型，順反異構(gòu)體產(chǎn)率比為1∶5.3，即反式構(gòu)型是

9、順式構(gòu)型的5.3倍。
　　對于撲草凈和乙草胺合劑血漿中的分析，萃取溶劑為乙酸乙酯、萃取時間20min被確定為是最佳分析條件?？疾鞊洳輧艉鸵也莅吩?.0～1000ng/mL的線性關(guān)系，乙草胺的回歸方程為y=0.0119x-0.0059，r2=0.9984;撲草凈的回歸方程為y=0.0952x-0.0087，r2=0.9980;檢出限為0.1 ng/mL;定量限0.5ng/mL。于空白血漿中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液10ng/mL、50ng/mL和

10、100ng/mL考察精密度和回收率?；厥章史秶?5.3％～100.4％之間。日內(nèi)精密度2.5％～7.1％，日間精密度4.7％～8.1％。用該方法進行了毒物代謝動力學(xué)研究，撲草凈和乙草胺在家兔體內(nèi)的毒物代謝動力學(xué)參數(shù):t1/2分別為13.49h和20.67h，Cmax分別為3.48μg/mL和3.42μg/mL。AUC0-∝分別為1.43μg·h/mL和1.35μg·h/mL。本研究發(fā)現(xiàn)撲草凈的代謝產(chǎn)物:N-單去異丙基和N-雙去異丙基代

11、謝產(chǎn)物，乙草胺的代謝產(chǎn)物:2-乙基-6-甲基苯胺和2-乙基-6-甲基苯胺基乙酰胺。本研究的動物實驗顯示撲草凈和乙草胺的毒性小，生物利用率低，代謝快。
　　結(jié)論:
　　本研究首次建立了固相微萃取結(jié)合GC-MS測定生物樣品中的百草枯。對比傳統(tǒng)的樣品前處理方法，固相微萃取有很多優(yōu)點，如無需有機溶劑，優(yōu)良的重現(xiàn)性和高靈敏度，非常適合分析生物樣品中的毒物殘留。該方法結(jié)合GC-MS和固相微萃取比先前用GC-MS測定生物樣品中百草枯的方法

12、簡單靈敏，可推薦用于測定百草枯意外中毒和法醫(yī)毒物分析中血漿和尿液中百草枯的含量測定。
　　本文采用頂空-固相微萃取-硼氫化鈉/氯化鎳催化還原結(jié)合GC-MS測定水中敵草快、百草枯，該方法快速、簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。且發(fā)現(xiàn)敵草快的還原產(chǎn)物中存在同分異構(gòu)體，這兩種同分異構(gòu)體的產(chǎn)率比是恒定的(1∶5.3)，本發(fā)現(xiàn)對于敵草快的含量分析有重要參考價值。
　　本研究建立了血漿中撲草凈和乙草胺含量測定方法，并用該方法進行了毒物代謝動力學(xué)研究