異煙肼的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究.pdf

1、目的: 1．建立生物材料中異煙肼的衍生化薄層色譜掃描快速定性檢測方法和高效液相色譜快速分析方法。 2．建立動物的異煙肼毒物動力學(xué)、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布和分解動力學(xué)研究動物模型。 3．研究異煙肼致死動物體內(nèi)的毒物動力學(xué)、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布和分解動力學(xué)，為異煙肼中毒(死)案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供實驗依據(jù)。 方法: 1．衍生化薄層色譜掃描和高效液相色譜檢測：血、組織樣品經(jīng)水楊醛衍生化處

2、理后，經(jīng)乙酸乙酯萃取，氯仿：甲醇(9：1)展開后，薄層色譜掃描法定性檢測其中異煙肼；經(jīng)水楊醛衍生化處理后，以磷酸二氫鉀—甲醇(65：35)為流動相，高效液相色譜分析，外標(biāo)法定量檢測其中異煙肼。 2．異煙肼在家兔體內(nèi)的毒物動力學(xué)研究：家兔6只，LD50劑量(280mg/kg)異煙肼灌胃，每只分別于給藥后0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6h各頸動脈取血1mL。水楊醛衍生化處理，薄層色譜掃描法定性，高效液相色譜外標(biāo)法定量檢測

3、其中異煙肼。 3．異煙肼在家兔體內(nèi)的動態(tài)分布研究：家兔15只，LD50劑量(280mg/kg)異煙肼灌胃染毒，分別于0.75、1、2、4、6h處死，迅速解剖動物，取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃壁、肌肉等組織。水楊醛衍生化處理，薄層色譜掃描法定性，高效液相色譜外標(biāo)法定量檢測其中異煙肼。 4．異煙肼在家兔體內(nèi)的死后分布研究：家兔6只，2倍LD50劑量(560mg/kg)異煙肼灌胃染毒，待家兔血壓、呼吸和心電全部消失后，迅速解剖

4、動物，取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦、胃壁、肌肉等組織。水楊醛衍生化處理，薄層色譜掃描法定性，高效液相色譜外標(biāo)法定量檢測其中異煙肼。 5．異煙肼在家兔體內(nèi)的死后再分布研究：雄性大鼠54只，1/2LD50劑量(330mg/kg)異煙肼灌胃染毒，1h后處死，置于20℃保存，不同時間(0、4、8、12、24、48、72、96h)各隨機取6只，采取腦、心、肺、肝、脾、腎、肌肉、心血、胃壁。水楊醛衍生化處理，薄層色譜掃描法定性，高效液相色

5、譜外標(biāo)法定量檢測其中異煙肼。 6．異煙肼分解動力學(xué)研究：①染毒檢材中異煙肼分解動力學(xué)研究。犬6只，4倍LD50劑量(800mg/kg)異煙肼灌胃染毒1h后處死，解剖動物，取心血和肝。每只犬心血和肝分四等份，其中三份分別置于20℃、4℃、-20℃保存；另一份心血中加氟化鈉至1％，另一份肝臟加4％甲醛溶液固定，20℃保存；分別于0h、12h、24h、48h、72h、5天、3周、4周、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月衍生化薄層

6、色譜掃描法和高效液相色譜法檢測其中異煙肼。②空白人血添加異煙肼分解動力學(xué)研究。取100ml空白人血，加入異煙肼純品10mg，超聲振蕩，靜置24h，分三份，保存于20℃；分別于0h、12h、24h、48h、72h、5天、3周、4周、2月、3月、4月衍生化薄層色譜掃描法和高效液相色譜檢測其中異煙肼。 7．統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—x±s)表示，t檢驗。藥物濃度—時間數(shù)據(jù)采用WinNonl

7、in藥代動力學(xué)軟件處理。 結(jié)果: 1．癥狀 LD50量組家兔在灌藥后，30min后出現(xiàn)呼吸抑制、昏迷、周身強直性痙攣，呈癲癇大發(fā)作樣抽搐，1.5-2h后癥狀緩解，實驗動物逐漸恢復(fù)正常。2倍LD50劑量組家兔在灌藥后30min左右出現(xiàn)呼吸抑制、昏迷、全身陣發(fā)性強直性痙攣，呈癲癇大發(fā)作樣抽搐，有不同程度的共濟失調(diào)，于2h±30min死亡。 2．毒物動力學(xué)異煙肼在家兔的毒物動力學(xué)過程呈一級動力學(xué)特征，符合一室開放模型，

8、吸收速率常數(shù)(K01)：5.828h-1；吸收半衰期(t1/2k01)：0.1189h；達(dá)峰時間(tmax)：0.847h；消除速率常數(shù)(K10)：0.5702h-1；消除半衰期(t1/2k10)：1.2156h；表觀分布容積(V)：4156.55L/kg；血藥濃度—時間曲線下面積(AUC)：118.138；峰濃度(Cmax)：52.3538μg/ml；滯后時間(lag time)：0.4075h。 3．動態(tài)分布異煙肼染毒(LD

9、50：280mg/kg)后0.75、1、2、4、6h處死家兔，其體內(nèi)異煙肼含量由高到低依次為胃、腎、肝、心、肺、腦、脾；肝、胃、腎、肺、腦、脾、心；胃、肝、腎、肺、腦、心、脾；胃、腎、肝、心、腦、脾、肺；胃、腎、肝、心、肺、腦、脾。各臟器中異煙肼的毒物動力學(xué)過程也呈一級動力學(xué)特征，符合血管外給藥一室開放模型，達(dá)峰時間為0.961-1.416h。心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和胃的消除半衰期分別為2.323h、2.052h、0.359h

10、、2.093h、4.887h、0.955h、3.465h。 4．死后分布2倍LD50劑量染毒死亡家兔體內(nèi)異煙肼含量為：胃(131.59±15.3μg/g)＞腎(52.98±8.6μg/g)＞血(45.4±12.2μg/g)＞玻璃體液(40.8±16.3μg/ml)＞心(31.224±16.15μg/g)＞腦(28.2±8.5μg/g)＞脾(25.62±1.37μg/g)＞肺(20.89±5.18μg/g)＞肌肉(20.3±7.5

11、μg/g)＞肝(18.5±12.61μg/g)。 5．死后再分布20℃保存時，死后2h大腦中異煙肼含量開始顯著升高(P＜0.05)；4h后大鼠心血、肺中異煙肼含量開始顯著升高(P＜0.05)；8h后心肌、肝、脾和腎中異煙肼含量開始顯著升高(P＜0.05)；心血、心、大腦中異煙肼含量死后12h達(dá)高峰，肝、脾、腎等臟器中異煙肼含量死后48h達(dá)高峰，肺中異煙肼含量死后8h達(dá)高峰。胃壁、肌肉中含量無顯著變化。死后大鼠肺、脾、腎、心、心血

12、、肝中異煙肼含量變化較腦、肌肉、胃壁明顯。 6．保存檢材中分解動力學(xué)20℃、0℃、-20℃和4％甲醛固定(20℃)保存染毒犬肝臟中，異煙肼含量在保存第12、12、24和48h顯著下降(P＜0.05)；20℃、0℃、-20℃、1％氟化鈉(20℃)保存染毒犬血液中，異煙肼含量在保存第12、24、24和48h內(nèi)顯著下降(P＜0.05)。保存血和肝中異煙肼的分解動力學(xué)均呈一級動力學(xué)過程。可用Ct=Ae—at+Be—βt表達(dá)，20℃，4℃

13、，-20℃和4％甲醛溶液固定保存染毒犬肝中，異煙肼的分解速率常數(shù)k和分解半衰期t1/2分別為4.75×10-3h-1、6.07d，2.74×10-3h-1、10.50d，0.829×10-3h-1、35.69d，0.178×10-3h-1、162.56d；20℃，4℃，-20℃保存和1％氟化鈉犬血液中異煙肼的分解速率常數(shù)k和分解半衰期t1/2分別為5.48×10-3h-1、5.27d，1.33×10-3h-1、21.61d，0.739×

14、10-3h-1、39.13d，0.279×10-3h-1、103.34d；人血中添加異煙肼的分解動力方程為Ct=14.233e-0.0176t+71.512e—00026t，分解速率常數(shù)k和分解半衰期t1/2分別為0.078×10-3(h-1)和289.9d。 小結(jié): 1．本文建立了生物檢材中異煙肼的衍生化薄層色譜掃描快速定性和高效液相色譜定量檢測方法，定性快速，定量準(zhǔn)確，操作簡便，可應(yīng)用于異煙肼中毒(死)案件的法醫(yī)學(xué)鑒

15、定和法醫(yī)毒物動力學(xué)研究。 2．本文建立了異煙肼的毒物動力學(xué)、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布和分解動力學(xué)研究動物模型，可應(yīng)用于異煙肼的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究。 3．異煙肼在家兔體內(nèi)的毒物動力學(xué)過程呈一級動力學(xué)特征，符合一室開放模型，心血中異煙肼的達(dá)峰時間為0.847h，消除半衰期為1.2156h：各臟器中異煙肼的達(dá)峰時間為0.961-1.416h，各臟器中消除半衰期分別為0.359h-4.887h。 4．染毒后不同時相

16、家兔體內(nèi)異煙肼的動態(tài)分布趨勢不同，提示法醫(yī)學(xué)實踐中可用各臟器中異煙肼的分布情況判斷死亡時相。 5.2LD50劑量染毒家兔體內(nèi)異煙肼死后分布(胃＞腎＞血＞玻璃體液＞心＞腦＞脾＞肺＞肌＞肝)與LD50劑量染毒家兔后2h的動態(tài)分布(胃＞腎＞玻璃體液＞肺＞腦＞血＞心＞肝)不同，提示不同劑量染毒家兔體內(nèi)異煙肼死后分布趨勢不同，異煙肼中毒(死)案件法醫(yī)學(xué)鑒定時，宜采取腎、玻璃體液、腦等受劑量影響小的臟器，并應(yīng)考慮中毒量及中毒死亡時間，進行全

17、面定性和定量分析。 6．異煙肼在大鼠體內(nèi)存在死后再分布，死后室溫下保存，大腦、心血、肺、心肌、肝、脾、腎中異煙肼含量均可顯著升高，而胃壁、肌肉中含量無顯著變化。提示異煙肼中毒(死)案件法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)考慮死后再分布對心血異煙肼濃度的影響，應(yīng)在死后4-8h內(nèi)解剖，并應(yīng)同時取死后再分布影響小的檢材外周血和肌肉同時檢測異煙肼含量。 7．異煙肼在保存血和肝臟中均可發(fā)生分解，保存溫度降低，肝臟甲醛固定或血中添加1％氟化鈉可減慢其分解