聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡轉(zhuǎn)染真核細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡轉(zhuǎn)染真核細胞的方法，從而提高白蛋白微泡轉(zhuǎn)基因效率。
　　 方法：(1)分別將25％人體白蛋白、葡萄糖和甘露醇等按一定的質(zhì)量比置于10ml瓶中，混合后用超聲振動儀聲振20S(電壓100V、電流0.5A)制得白蛋白微泡(Albumin Microbubbles，AMB)；(2)將微泡包裹氣體由空氣換為全氟丙烷氣體，并在微泡組分中添加聚乙二醇，以提高微泡穩(wěn)定性；(3)在微泡組分中添加聚乙烯亞胺，獲得聚

2、乙烯亞胺修飾包裹全氟丙烷氣體微泡(PAMB)，通過轉(zhuǎn)染CHO細胞，36h后消化細胞流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例，最大轉(zhuǎn)基因效率時質(zhì)量比即為最佳白蛋白與聚乙烯亞胺質(zhì)量比；(4)使用納米激光粒度儀和Zeta電位分析儀檢測微泡表面電位；(5)將質(zhì)粒DNA分別與AMB和PAMB按一定的比例混合后，加入SYBR Green，SYBR Green與DNA結(jié)合后可被激發(fā)出綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)合質(zhì)粒DNA的微泡可發(fā)出綠色熒光；如果微泡未

3、與質(zhì)粒DNA結(jié)合則只能看到綠色熒光而無微泡形態(tài)；(6)轉(zhuǎn)染CHO，293T,M231，293，SK-Hep-1，SKBR-3，MCF-7，COS8種細胞，使用流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例以比較PEI、白蛋白+PEI、Lipofectamine2000和PAMB的轉(zhuǎn)基因效率；(7)使用CCK-8試劑盒檢測PEI，Lipofectamine2000和PAMB細胞毒性及轉(zhuǎn)染后細胞增值能力，細胞活性=PEI組，Lipofectamine20

4、00組和PAMB組吸光值/未處理組吸光值，細胞增殖指數(shù)=加入轉(zhuǎn)染試劑之前和加入轉(zhuǎn)染試劑作用6h之后0h，24h，48h，72h吸光值/加入轉(zhuǎn)染試劑之前吸光值；(8)使用COS細胞比較AMB，SonoVue微泡和PAMB在超聲介導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因效率，超聲強度為0.5W/cm2、1.0W/cm2和2.0W/cm2，時間分別為30S和60S；(9)探討超聲在微泡轉(zhuǎn)基因中的作用，制備CHO細胞爬片，分別按如下分組加入試劑：①只加入DNA熒光染料NA-

5、Green(不能主動進入細胞)；②AMB+DNA+NA-Green；③AMB+DNA+NA-Green+超聲(1.0W/cm2，30S)；④PAMB+NA-Green；⑤PAMB+DNA+NA-Green；⑥PAMB+DNA+NA-Green+超聲(1.0W/cm2，30S)，37℃、5%CO2培養(yǎng)6h后吸取培養(yǎng)液，使用PBS沖洗三遍，每孔加入1ml1%多聚甲醛固定15min，用PBS沖洗兩遍，然后使用共聚焦熒光顯微鏡觀察拍照。

6、　　 結(jié)果：(1)將微泡包裹氣體由空氣換為全氟丙烷氣體，并在微泡組分中添加聚乙二醇后，微泡穩(wěn)定性大大提高，半衰期由原來的半小時至數(shù)天延長到6個月；(2)通過轉(zhuǎn)染CHO細胞，得到最佳白蛋白與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為125:1，此時PAMB轉(zhuǎn)染CHO細胞最大效率可達55%左右；(3)納米激光粒度儀檢測顯示：AMB平均直徑1400nm左右，而PAMB平均直徑在600nm左右，Zeta電位分析儀檢測結(jié)果示：AMB的表面電位為(-59.28±3.4

7、8)mV，而PAMB的表面電位為(-44.56±0.75)mV；(4)結(jié)合質(zhì)粒DNA的微泡(PAMB)在熒光顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光，AMB可見大量綠色熒光而未見微泡形態(tài)，未添加DNA的PAMB未見熒光；(5)通過8種細胞比較PEI、白蛋白+PEI、Lipofectamine2000和PAMB的轉(zhuǎn)基因效率，發(fā)現(xiàn)PAMB組明顯高于單純PEI組和白蛋白+PEI組(P＜0.05)，而在293T、COS、SKBR-3和SK-Hep-1細胞PAMB

8、的轉(zhuǎn)基因效率高于Lipofectamine2000，在CHO、293、M231和MCF-7細胞轉(zhuǎn)基因效率低于Lipofectamine2000(P＞0.05)，白蛋白+PEI的轉(zhuǎn)基因效率低于單純PEI的轉(zhuǎn)基因效率(P＜0.05)：(6)PEI，PAMB和Lipofectamine2000均具有細胞毒性，PAMB的細胞毒性低于PEI和Lipofectamine2000(P＜0.05)，且使用PAMB轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力明顯高于使用PEI和L

9、ipofectamine2000轉(zhuǎn)染的細胞(P＜0.05)；(7)通過實施不同強度和時間的超聲，聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡微泡轉(zhuǎn)基因效率在各種強度和時間下均明顯高于白蛋白微泡和SonoVue微泡(P＜0.05)，不同超聲強度和時間下聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡微泡轉(zhuǎn)基因效率在COS和CHO兩種細胞均沒有顯著差異，且與未超聲組相比略有下降，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；(8)超聲介導(dǎo)AMB和SonoVue微泡破裂轉(zhuǎn)基因時，質(zhì)粒DNA依靠空化效