聚乙烯亞胺介導(dǎo)BMP-7基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)老年大鼠骨折愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文設(shè)計(jì)利用納米陽(yáng)離子多聚物PEI(13KDa，高分枝)為基因載體，介導(dǎo)已被證實(shí)具有較強(qiáng)骨誘導(dǎo)活性的BMP-7基因，通過(guò)體內(nèi)(in vivo)轉(zhuǎn)染的方式，對(duì)老年大鼠的骨折修復(fù)過(guò)程加以干預(yù)，希望找到一個(gè)高效的、具有一定實(shí)用性的促進(jìn)骨折愈合的生物學(xué)方法，為增強(qiáng)老年骨折修復(fù)能力、改善老年骨折預(yù)后的研究作出貢獻(xiàn)。 第一部分：PEI介導(dǎo)的體外基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究。 1.對(duì)PEI的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)MTT法觀察不同濃度PEI對(duì)培養(yǎng)

2、細(xì)胞存活率的影響，對(duì)PEI的安全性加以評(píng)價(jià)。結(jié)果PEI在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響。 2.檢測(cè)PEI的粒徑特征。應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察PEI微粒、PEI和DNA混合物微粒的微觀形態(tài)，PEI在良好的分散狀態(tài)下表現(xiàn)為均勻的多分支形態(tài)，PEI和pEGFP-N<,1>形成的混合物微粒表現(xiàn)為均勻的類球形。應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射法觀察PEI和PEI/DNA復(fù)合物的粒徑，結(jié)果顯示PEI微粒的粒徑在70nm左右，濃縮DNA形成的復(fù)合物粒徑

3、119nm左右。 3.PEI結(jié)合DNA的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。按照不同比例將PEI和目的基因pEGFP-N<,1>混合，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察不同比例PEI和質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物的泳動(dòng)速率，檢測(cè)PEI結(jié)合DNA的能力及最佳比例范圍。 4.PEI轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。按照不同比例應(yīng)用PEI轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N<,1>體外轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，尋找PEI的最佳轉(zhuǎn)染條件。以陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectAMINE2000為

4、對(duì)照，評(píng)價(jià)PEI的轉(zhuǎn)基因能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEI在體外轉(zhuǎn)染的最佳比例是其體積(濃度固定時(shí))和質(zhì)粒DNA的比值為3。PEI的轉(zhuǎn)染效率和陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipo2000比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：PEI的粒徑復(fù)合納米載體的特征。對(duì)細(xì)胞的毒性很小，在體外轉(zhuǎn)染條件下有較高的安全性。能充分結(jié)合質(zhì)粒DNA。體外轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染效率和PEI與DNA的比值有關(guān)。PEI時(shí)安全高效的非病毒基因載體。 第二部分：PEI介導(dǎo)的BMP-7基因轉(zhuǎn)染成纖維

5、細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 1.獲得BMP-7基因片段的全長(zhǎng)序列并構(gòu)建真核表達(dá)載體。從人骨肉瘤細(xì)胞U2OS中，抽提總mRNA。設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR從總mRNA抽提產(chǎn)物中擴(kuò)增BMP-7基因的cDNA全長(zhǎng)片段。用酶切電泳鑒定片段長(zhǎng)度。將PCR產(chǎn)物連接至pcDNA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)構(gòu)建產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳和測(cè)序鑒定序列的完整和準(zhǔn)確性。結(jié)果：通過(guò)RT-PCR獲得了完整的BMP-7cDNA序列，酶切片段長(zhǎng)度顯示其大小在1000bp和2000b

6、p之間，與BMP-7基因長(zhǎng)度吻合。測(cè)序結(jié)果顯示基因序列完整準(zhǔn)確。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BMP-7經(jīng)酶切、電泳證實(shí)載體構(gòu)建成功。 2.利用PEI介導(dǎo)BMP-7基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。按照常規(guī)方法培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，PEI與pcDNA3.1-BMP-7質(zhì)粒按照第一部分檢測(cè)結(jié)果提示的比例混合，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，通過(guò)Wextern-blot方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞表達(dá)BMP-7的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)Western-b

7、lot檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的BMP-7蛋白明顯增加，證明PEI成功將目的基因轉(zhuǎn)入并表達(dá)。成纖維細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞被轉(zhuǎn)入BMP-7基因并表達(dá)，使細(xì)胞外BMP-7蛋白含量增高。 結(jié)論：通過(guò)RT-PCR方法從人骨肉瘤細(xì)胞總mRNA中擴(kuò)增的BMP-7cDNA片段完整。利用PEI轉(zhuǎn)染試劑能夠成功在體外將真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BMP-7轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞。成纖維細(xì)胞合成分泌BMP-7蛋白。該實(shí)驗(yàn)為利用PEI介導(dǎo)BMP-7基因促進(jìn)骨折愈合

8、奠定了理論基礎(chǔ)。 第三部分：PEI介導(dǎo)EGFP基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染小鼠肌肉細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。大量制備pEGFP-N<,1>質(zhì)粒。將試驗(yàn)動(dòng)物(昆明小鼠)隨機(jī)分為三組，一組為試驗(yàn)組，兩組為對(duì)照。通過(guò)直接注射方法，利用PEI轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N<,1>質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組小鼠大腿肌肉組織。分別用總體積相同的PBS和pEGFP-N<,1>質(zhì)粒DNA為對(duì)照。標(biāo)本經(jīng)冰凍切片后在激光聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果：利用PEI轉(zhuǎn)染

9、試劑能夠成功的將增強(qiáng)GFP基因轉(zhuǎn)入小鼠肌肉組織內(nèi)。EGFP蛋白的表達(dá)情況隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間變化。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即可觀察到綠色熒光，第3天達(dá)到最高，第8天基本消失。對(duì)照組基本為陰性表現(xiàn)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過(guò)直接經(jīng)皮注射的方法，PEI載體能夠成功將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠肌肉組織內(nèi)，并且沒(méi)有明顯的副作用。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的基因治療中可以利用PEI作為基因載體。 第四部分：PEI介導(dǎo)的BMP-7基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)老年大鼠骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究。

10、 建立老年大鼠股骨骨折的動(dòng)物模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(PEI載體介導(dǎo)BMP-7基因治療組)和對(duì)照組B(生理鹽水對(duì)照組)、C(BMP-7質(zhì)粒對(duì)照組)。通過(guò)直接注射的方法，利用PEI載體介導(dǎo)BMP-7基因轉(zhuǎn)染入大鼠骨折骨折端。骨折后2、4、8周分別攝x光片、取骨痂標(biāo)本作HE染色、Ⅰ型膠原染色，觀察骨折愈合情況。骨折后第8周，取完整股骨標(biāo)本作骨密度檢測(cè)和抗彎曲生物力學(xué)檢測(cè)，觀察骨折愈合質(zhì)量。結(jié)果：第8周老年大鼠骨折仍未完全愈合。

11、與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組骨痂組織出現(xiàn)時(shí)間早，軟骨面積較大，軟骨骨化過(guò)程相對(duì)較早，成骨面積增大。實(shí)驗(yàn)組骨痂的骨密度和抗彎曲生物力學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，骨痂質(zhì)量明顯改善。 結(jié)論：利用PEI載體介導(dǎo)BMP-7基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染骨折端，能夠加快老年大鼠的骨折愈合速度，改善骨折愈合質(zhì)量，縮短老年大鼠骨折愈合時(shí)間。通過(guò)直接注射方式的體內(nèi)基因治療，可以對(duì)老年大鼠的骨折愈合過(guò)程發(fā)揮作用。PEI載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因治療方法，在促進(jìn)老年大鼠骨折愈合研究領(lǐng)域具有重