厄貝沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞TRPC6表達(dá)的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)的主要微血管并發(fā)癥之一，其早期的主要臨床表現(xiàn)為微量白蛋白尿。近年來大量研究表明，足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿的主要原因之一，因此成為研究熱點(diǎn)。瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白6(transient receptorpotential cation channel，TRPC6)是構(gòu)成足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白的主要成分之一，它的表達(dá)

2、異常可導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。本課題研究血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blockers，ARB)厄貝沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)的條件永生化小鼠足細(xì)胞TRPC6表達(dá)的影響，探討厄貝沙坦在糖尿病腎臟疾病中保護(hù)足細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　方法:首先將體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞分為五組:分為高滲對(duì)照組(甘露醇30mmol/L+葡萄糖5mmol/L)，正常對(duì)照組(葡萄糖5mmol/L)、實(shí)驗(yàn)組(葡萄糖濃度分別為15mmol/L、2

3、5mmol/L和35mmol/L)，倒置顯微鏡下觀察不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)足細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力變化，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)足細(xì)胞TRPC6表達(dá)分布變化，采用Western印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)足細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)變化，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈鎖反應(yīng)法(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)

4、不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)足細(xì)胞TRPC6 mRNA的表達(dá)變化。其次高糖(葡萄糖25mmol/L)刺激足細(xì)胞，以刺激后0h，12h，24h和48h為時(shí)間觀察點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集提取的細(xì)胞總蛋白和總mRNA，采用WB檢測(cè)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)引起TRPC6蛋白的表達(dá)變化，采用RT-PCR法檢測(cè)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)引起TRPC6 mRNA的表達(dá)變化。最后將細(xì)胞分為五組:正常對(duì)照組、高糖組、高糖+厄貝沙坦組（10-7mol/L）、高糖+厄

5、貝沙坦組(10-6mol/L)、高糖+厄貝沙坦組(10-5mol/L)，倒置顯微鏡下觀察不同濃度厄貝沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力變化，采用WB檢測(cè)不同濃度厄貝沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞48h后引起足細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)變化，采用RT-PCR法檢測(cè)厄貝沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞48h后引起足細(xì)胞TRPC6 mRNA的表達(dá)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有的數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來表

6、示，各組之間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.隨著葡萄糖濃度的增加，光鏡下足細(xì)胞胞體明顯變小，足突明顯減少或消失;CCK-8檢測(cè)到葡萄糖25mmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用最明顯;免疫細(xì)胞化學(xué)可見隨著葡萄糖濃度的增加，TRPC6主要集中表達(dá)于足細(xì)胞胞膜，沿足突分布更加明顯;WB和RT-PCR檢測(cè)到TRPC6蛋白和mRNA表達(dá)量逐漸增加，

7、以25mmol/L變化最明顯。2.高糖刺激足細(xì)胞后，與0h相比，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，足細(xì)胞TRPC6蛋白和mRNA表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)，在48h達(dá)到高峰，呈一定的時(shí)間依賴性。3.與正常對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)的TRPC6表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，與高糖組相比，高糖+厄貝沙坦組隨厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾?，TRPC6蛋白和mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)，呈劑量依賴性。
　　結(jié)論:高糖能夠使足細(xì)胞TRPC6表達(dá)上調(diào)，厄貝沙坦