siRNA沉默CTGF表達(dá)對高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)臨床上以持續(xù)性蛋白尿和腎功能進(jìn)行性減退并最終進(jìn)展至終末期腎衰竭為主要特征,目前是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一。在DN發(fā)病早期,以尿微量白蛋白為主要表現(xiàn),而尿蛋白是加重慢性腎臟病發(fā)展的因素之一,因此研究蛋白尿的發(fā)生機(jī)制,抑制尿蛋白生成是DN研究熱點(diǎn)之一。近年發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞在DN的發(fā)展過程中起重要作用,足細(xì)胞損傷后濾過膜電荷屏障和孔徑屏障的破壞,是蛋白尿形成的重要原

2、因。足突間的裂孔膜蛋白的完整性是腎小球?yàn)V過機(jī)械屏障的關(guān)鍵,細(xì)胞膜表面及裂孔膜表面帶負(fù)電荷的唾液酸糖蛋白,是腎小球?yàn)V過電荷屏障的重要組成部分,這些蛋白的損傷或表達(dá)下降都可引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙。裂孔膜蛋白主要包括了nephrin、podocin等蛋白。通過二聚體形成拉鏈樣結(jié)構(gòu),nephrin構(gòu)成了裂孔隔膜的分子基礎(chǔ)。而podocin可與nephrin相互作用形成復(fù)合體錨定于足細(xì)胞肌動蛋白骨架上,構(gòu)成了腎小球正常結(jié)構(gòu)及維持了濾過功能。近年

3、來,結(jié)締組織生長因子(connectivetissue growth factor,CTGF)在DN中的致病作用逐漸引起廣泛關(guān)注,但主要著重于探索CTGF與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)導(dǎo)致腎小管肥大、間質(zhì)纖維化的關(guān)系。而CTGF是否參與了DN早期足細(xì)胞損傷,及其調(diào)節(jié)機(jī)制卻鮮見報道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過Realtime PCR,Western蛋白印跡分析、siRN

4、A干擾等技術(shù),探討CTGF對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 一、研究目的：
　　 觀察高糖培養(yǎng)對小鼠足細(xì)胞CTGF、nephrin、podocin mRNA和蛋白表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)染pshRNA-CTGF-1質(zhì)粒抑制CTGF表達(dá)前、后小鼠足細(xì)胞CTGF、nephrin、podocin mRNA及蛋白水平的變化。
　　 二、研究方法：
　　 1.利用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件設(shè)計3條針對CTGF的siRNA

5、s(siRNA—CTGF-1、siRNA-CTGF-2及siRNA-CTGF-3)和1條無關(guān)序列(siRNA—CTGF-neg)作為陰性對照,并合成包含這4條siRNAs的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)的模板脫氧寡核苷酸序列。
　　 2.根據(jù)合成的shRNA模板脫氧寡核苷酸序列,分別將其插入pGenesil—1質(zhì)粒,完成特異性siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建,共構(gòu)4種質(zhì)粒:pshRNA-CTGF-1、pshRNA-CTGF-2、pshRNA

6、-CTGF-3、表達(dá)無關(guān)序列的質(zhì)粒pshRNA—CTGF-neg。
　　 3.把上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α E.coli菌液,挑取生長較好的單克隆菌落,搖菌,提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切及基因測序鑒定。根據(jù)鑒定,選取正確的細(xì)菌克隆進(jìn)行大量的質(zhì)粒提取。
　　 4.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到高糖組培養(yǎng)48小時后的細(xì)胞,用空質(zhì)粒載體做空白對照。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基中,于48h收集細(xì)胞,以RT-PCR檢測CTGFmRNA的表達(dá)水平。挑選出si

7、RNA—CTGF-1、siRNA-CTGF-2及siRNA-CTGF-3中抑制效果最好的siRNA表達(dá)載體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 5.全部細(xì)胞分成6組培養(yǎng):正常對照組(D—glu1g/L)、高糖組(D-glu4.5g/L)、等滲對照組(D-glu1 g/L+甘露醇3.5g/L)、高糖+空白對照組(D-glu4.5g/L+空載)、高糖+陰性對照組(D-glu4.5g/L+pshRNA—CTGF-neg)、高糖+siRNA—CTGF

8、組(D-glu4.5g/L+siRNA-CTGF)。
　　 6.各組分別培養(yǎng),于24、48h時收集細(xì)胞以Real-time熒光定量PCR檢測各組CTGF、nephrin、podocin mRNA表達(dá)水平。
　　 7.各組分別培養(yǎng),于24、48h時收集細(xì)胞以Western blot方法檢測CTGF、nephrin、podocin的蛋白表達(dá)水平。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.高糖刺激可上調(diào)小鼠足細(xì)胞CTGF

9、mRNA及蛋白水平,同時伴有nephrin、podocin mRNA及蛋白表達(dá)水平的下降。
　　 2.轉(zhuǎn)染siRNA-CTGF-1能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞的CTGFmRNA及蛋白的表達(dá)增多,及nephrin、podocin mRNA及蛋白表達(dá)減少。這些變化與轉(zhuǎn)染方式及過程無關(guān)。提示CTGF是介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的重要因素。
　　 四、結(jié)論：
　　 本研究成功觀察到高糖條件下培養(yǎng)的足細(xì)胞CTGF的mRNA及