地塞米松對(duì)腎小球足細(xì)胞CD2AP-TRPC6表達(dá)和分布的影響;激素耐藥型腎病綜合征患兒TRPC6基因變異的研究.pdf

1、第一部分 地塞米松對(duì)腎小球足細(xì)胞CD2AP/TRPC6表達(dá)和分布的影響
　　 目的：
　　 足細(xì)胞的裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）是腎小球選擇性濾過(guò)功能中最重要的部分，CD2相關(guān)蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）、nephrin、podoci

2、n等重要的裂孔隔膜分子共同組成一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物以維持足突和裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。本研究借助小鼠腎小球足細(xì)胞系，觀察嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN)刺激足細(xì)胞，及給予地塞米松（dexamethasone，DEX）干預(yù)后，足細(xì)胞分子CD2AP、TRPC6表達(dá)及分布的變化，探討地塞米松對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及CD2AP、TRPC6與足細(xì)胞損傷修復(fù)的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、條件

3、永生型小鼠足細(xì)胞系（mouse podocyte clone 5，MPC5）培養(yǎng)：復(fù)蘇MPC5細(xì)胞，于33℃培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)，平均3～4天細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底達(dá)80％，傳代，置于37℃中培養(yǎng)，約10～14天分化成熟，此時(shí)為分化態(tài)的MPC5，可用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2、設(shè)立對(duì)照組、PAN刺激組和DEX干預(yù)組。對(duì)照組用含0.02％ DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，PAN刺激組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PAN，DEX干預(yù)組在細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)

4、加入PAN和DEX，處理后8h，24h和48h觀察細(xì)胞形態(tài)并攝相，采用圖像處理軟件分析各組細(xì)胞形態(tài)及胞體面積的差別。采用RT-PCR、Western blot和間接免疫熒光染色檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)CD2AP和TRPC6 mRNA、蛋白表達(dá)量及分布變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、正常情況下，足細(xì)胞在33℃含有γ-干擾素的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快，細(xì)胞排列緊密，小而突起，呈鵝卵石樣，足突樣結(jié)構(gòu)少見(jiàn)；在37℃無(wú)γ-干擾素的培養(yǎng)液中生

5、長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度明顯減緩，足細(xì)胞呈星形，胞體多透明，大并伸出樹(shù)枝樣突起，相鄰細(xì)胞間形成相互連接。PAN刺激后足細(xì)胞胞體明顯縮?。≒<0.05），出現(xiàn)足突回縮、消失，失去細(xì)胞間連接，DEX干預(yù)后細(xì)胞胞體明顯大于刺激組（P<0.05），大部分足細(xì)胞維持正常的足突形態(tài)。
　　 2、正常情況下，CD2AP mRNA和蛋白在足細(xì)胞有一定量表達(dá)。與對(duì)照組比較，PAN損傷細(xì)胞后8h，CD2AP mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.05），一直持續(xù)至刺激

6、后48h。CD2AP蛋白在PAN刺激8h，其表達(dá)無(wú)明顯變化，在PAN刺激24h和48h后，其蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.01）。與PAN刺激組相比，DEX干預(yù)后8h CD2APmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，24h及48h時(shí)mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05），趨向于正常水平。DEX干預(yù)8h、24h和48h，CD2AP蛋白表達(dá)明顯增多，趨于正常（P<0.01）。
　　 3、正常情況下，TRPC6蛋白在足細(xì)胞有一定量表達(dá)。與對(duì)照組比較，PA

7、N損傷細(xì)胞后8h，TRPC6蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，在PAN刺激24h和48h后TRPC6蛋白表達(dá)顯著增高（P<0.01）；地塞米松干預(yù)后8h，TRPC6蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，干預(yù)24h后，TRPC6蛋白表達(dá)下降，趨于正常（P<0.05），48h后表達(dá)顯著下降（P<0.01）。
　　 4、CD2AP在對(duì)照組均勻分布于細(xì)胞核膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞膜；PAN刺激8h后，呈顆粒狀分布于細(xì)胞漿和核周，刺激48h后出現(xiàn)胞膜、胞漿分布缺失；DEX干預(yù)后

8、各時(shí)間點(diǎn)CD2AP在胞膜、胞漿的分布缺失較PAN刺激組明顯改善，干預(yù)48h后，CD2AP在足細(xì)胞分布未達(dá)完全恢復(fù)正常，胞漿尚有少量顆粒樣分布。
　　 5、TRPC6在對(duì)照組呈線狀均勻分布于胞膜，在胞質(zhì)內(nèi)少量分布；PAN刺激24h后TRPC6主要沿細(xì)胞膜呈不連續(xù)性分布，胞質(zhì)內(nèi)分布增多；刺激48h后，細(xì)胞膜分布增多，部分細(xì)胞膜分布缺失，聚集成顆粒狀，胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布。DEX干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)TRPC6在細(xì)胞膜分布較均勻，在整個(gè)細(xì)胞的分布較

9、前明顯改善，趨于正常。
　　 結(jié)論：
　　 PAN刺激足細(xì)胞損傷時(shí)，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，CD2AP、TRPC6表達(dá)和分布異常；DEX作用于足細(xì)胞后，CD2AP、TRPC6表達(dá)和分布趨于穩(wěn)定正常，DEX可能通過(guò)維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞和抗蛋白尿的作用。
　　 第二部分 激素耐藥型腎病綜合征患兒TRPC6基因變異研究
　　 目的：
　　 腎病綜合征(nephrotic syndrome

10、，NS)是小兒泌尿系統(tǒng)疾病中的常見(jiàn)病。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。治療藥物以腎上腺皮質(zhì)激素為主。約有20％患兒對(duì)激素耐藥，反復(fù)遷延不愈者最終發(fā)展至終末期腎病。近年研究證實(shí)TRPC6突變可導(dǎo)致腎病發(fā)生，臨床主要表現(xiàn)為激素耐藥，大量蛋白尿。激素耐藥性腎病綜合征（steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS）的治療一直是臨床棘手問(wèn)題。本研究對(duì)50例SRNS患兒進(jìn)行TRPC6基因分析，以探討TRPC6基因與S

11、RNS的臨床特征點(diǎn)和疾病易感性的關(guān)系，為我們進(jìn)行基因診斷、遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，估計(jì)疾病預(yù)后以及指導(dǎo)臨床治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 收集來(lái)自廣東地區(qū)漢族50例SRNS患兒和30例正常兒童的病例資料（包括發(fā)病年齡、隨訪時(shí)間、發(fā)病至遲發(fā)耐藥時(shí)間、遲發(fā)耐藥前復(fù)發(fā)次數(shù)和治療方案等臨床數(shù)據(jù)）。采集受試者外周血，采用離心吸附法提取基因組DNA。采用PCR方法分別擴(kuò)增TRPC6基因外顯子2（exon2）、外顯子12(exon12

12、)、外顯子13 (exon13)及部分內(nèi)含子，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行直接測(cè)序，使用DNAman軟件將所得結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)；比較兩組受試者的等位基因頻率及基因型頻率，統(tǒng)計(jì)其分布差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.所有受試者均未檢測(cè)到TRPC6基因突變；
　　 2.5例SRNS患兒存在單核苷酸多態(tài)性，SNP：135890C＞T，以往未見(jiàn)報(bào)道

13、。等位基因頻率（C/T）分別為0.94、0.06；兩組間SNP的基因頻率和基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　 3.檢測(cè)出SNP的患兒其發(fā)病年齡明顯晚于未檢出SNP的患兒，且更易早期出現(xiàn)遲發(fā)耐藥（P＜0.05）。5例檢測(cè)出SNP的患兒，其中2例為腎組織活檢為FSGS，1例為系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN），其余兩例未做腎組織活檢。
　　 4.SRNS患兒中共有17例患兒接受腎穿刺活檢，10例為FSGS，臨床表

14、現(xiàn)均為反復(fù)出現(xiàn)大量蛋白尿，其中2例因治療效果不佳進(jìn)展為終末期腎病而死亡；
　　 結(jié)論：
　　 1.廣東地區(qū)漢族兒童存在由TRPC6基因135890C>T多態(tài)性所致的C、T兩種等位基因，2種組合基因型CC型和CT型；
　　 2.SRNS和正常對(duì)照組相比，TRPC6基因SNP在SRNS患兒的基因型和等位基因頻率分布均無(wú)顯著性差異，其基因多態(tài)性可能不是本研究中兒童激素耐藥型腎病綜合征發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)；
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