EDF的清除自由基活性和對大腸桿菌的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　EDF是2007年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種群體感應信號分子，為一個線性的五肽，其氨基酸序列為NNWNN。報道認為EDF參與mazEF介導的細胞程序性死亡途徑。然而，EDF在細胞間的傳遞方式和“信號通路”尚不明確。本論文將研究EDF可能的作用靶點和作用機制，以及EDF對大腸桿菌存活的影響。
　　方法:
　　1、用Amp處理大腸桿菌，得到裂解液，通過親和柱層析和SDS-PAGE電泳得到與EDF親和的主要條帶，經(jīng)串

2、聯(lián)質譜鑒定和 Mascot檢索對比鑒定與 EDF親和的蛋白。
　　2、SDS法提取OmpC并純化；Ni-螯合親和色譜純化出N-端融合了His-tag的重組GS；構建重組質粒的方法誘導表達GDH，用His TrapHP鎳柱純化GDH；驗證EDF及其突變體對GS的作用，驗證EDF對GDH的作用。
　　3、合成 EDF及其一系列丙氨酸和甘氨酸替換的類似物，檢測了 EDF對DPPH、超氧自由基和羥自由基的清除作用。
　　4、驗

3、證EDF抵御羥自由基誘導的脂質、蛋白質和DNA損傷的作用。
　　5、驗證EDF與Amp聯(lián)用時的殺菌效果。
　　結果:
　　1、我們將質譜檢測得到的多肽片段指紋圖譜在線檢索，與大腸桿菌的蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，結果顯示，EDF能夠與大腸桿菌的外膜孔蛋白（OmpC）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）結合。
　　2、EDF及其不同的突變體均對GS的活力有不同程度的抑制作用，對GDH則沒有作用。
　　3、

4、EDF不能清除DPPH自由基，能夠清除超氧自由基和羥自由基，尤其是對于羥自由基的清除作用非常顯著。
　　4、EDF能夠保護蛋白質、脂質和DNA免受羥自由基的破壞。
　　5、EDF與抗生素聯(lián)用會抑制抗生素氨芐青霉素（Amp）的抗菌作用。
　　結論:
　　1、EDF可能是通過OmpC進入大腸桿菌細胞內(nèi)的。
　　2、EDF可以通過抑制 GS的活性來影響大腸桿菌對氮源的使用，從而行使其信號分子的作用，導致細菌的細胞

5、程序性死亡。
　　3、EDF能特異清除羥自由基，中間的色氨酸殘基對EDF的羥自由基清除能力至關重要。
　　4、EDF能保護脂質、蛋白質和 DNA免受羥自由基的損傷，這種保護呈現(xiàn)劑量依賴效應。
　　5、EDF在很低的生理濃度下能抑制Amp的抗菌作用，結合Cell雜志2007年報道的Amp類抗生素的通用殺菌機制有可能是由于能夠刺激E. coli產(chǎn)生羥自由基（.OH），我們認為EDF除了作為群體感應因子導致細菌的死亡外，還可