喹賽多對大腸桿菌的抗菌作用研究.pdf

1、喹賽多是新一代喹噁啉類的抗菌促生長藥物，因其抗菌促生長作用顯著、毒副作用低、使用范圍廣而倍受關(guān)注，關(guān)于喹賽多的抗菌機(jī)理目前還沒有研究。通過對喹賽多抗菌機(jī)理的研究有助于進(jìn)一步闡明喹噁啉類藥物的抗菌作用方式，加快喹噁啉類藥物的研發(fā)速度，為喹噁啉類藥物的合理、安全使用提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選取對喹賽多最敏感的大腸桿菌C84010作為實(shí)驗(yàn)菌種，研究表明，喹噁啉類藥物作用于細(xì)菌后可以損傷細(xì)菌的DNA并抑制DNA的合成，具有顯著的厭氧選擇活性，并在細(xì)

2、菌內(nèi)還原活化產(chǎn)生自由基。目前尚未確定喹噁啉類藥物在抗菌作用中所產(chǎn)生的自由基種類，其是否有作用靶點(diǎn)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)將分別在有氧和厭氧條件下對喹賽多作用大腸桿菌后細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生的自由基進(jìn)行檢測，研究各種自由基在喹賽多抗菌過程中的作用，并對藥物作用后細(xì)菌的形態(tài)變化和DNA損傷進(jìn)行研究，找到喹賽多作用的主要方式和靶點(diǎn)。藥物與受體的結(jié)合是藥物的作用方式之一，大腸桿菌內(nèi)是否存在喹賽多抗菌作用的受體目前還沒有研究，本實(shí)驗(yàn)將采用放射性標(biāo)記的方法對大腸桿菌內(nèi)

3、是否存在喹賽多作用受體進(jìn)行研究。
　　 1.自由基在喹賽多抗菌作用中的功能研究
　　 本實(shí)驗(yàn)將分別在有氧和厭氧條件下對喹賽多及其代謝物的抗菌活性進(jìn)行研究，并對喹賽多代謝過程中產(chǎn)生的自由基進(jìn)行檢測，確定自由基在其抗菌過程中的作用。并對喹賽多作用后細(xì)菌的DNA損傷進(jìn)行研究，確定自由基和DNA損傷的關(guān)系，同時(shí)實(shí)驗(yàn)將對喹賽多作用后細(xì)菌細(xì)胞膜損傷和形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行研究。
　　 喹賽多(CYA)在厭氧條件下對大腸桿菌C8401

4、0的MIC和MBC分別為1、4μg/ml，在有氧條件下的MIC和MBC分別為16、128μg/ml，這說明喹賽多和其他喹噁啉類藥物一樣具有明顯的厭氧選擇活性。對其代謝物Cy10、Cy2、Cy1、Cy17、CY6的MIC測定發(fā)現(xiàn)，只有代謝物Cy17(MIC=1μg/ml)具有抗菌活性，而兩種脫一氧產(chǎn)物(CY10、CY2)和一種脫二氧產(chǎn)物(CY1)都沒有抗菌活性，這說明喹賽多1和4號位上的N→O基團(tuán)是喹賽多抗菌作用的必要條件。在有氧條件下，

5、在喹賽多處理的細(xì)菌培養(yǎng)基上清液中檢測到了CYA、CY10、CY2，沒有檢測到CY1；在厭氧條件下，培養(yǎng)基上清液中檢測到了CYA、CY10、CY2、CY1；無論是在有氧或是厭氧條件下都在細(xì)菌體內(nèi)檢測到了CYA、CY10、CY2、CY1。這說明無論在有氧還是厭氧條件下，喹賽多都可以進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)發(fā)生脫氧代謝產(chǎn)生脫一氧和脫二氧代謝產(chǎn)物。
　　 在厭氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多作用后的細(xì)菌內(nèi)均有一定量的ROS產(chǎn)生，其

6、產(chǎn)生量隨著藥物濃度的增加而增加，在1h時(shí)ROS的產(chǎn)生量達(dá)到最大。在有氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多處理的細(xì)菌內(nèi)均有一定量的超氧自由基產(chǎn)生，其隨著藥物濃度和時(shí)間的增加顯著上升，4h時(shí)超氧自由基的量可以達(dá)到0h時(shí)的16倍左右。經(jīng)有抗菌活性的代謝物Cy17作用后細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生了和喹賽多大致等量的超氧自由基，而其他代謝物(CY10、CY2、CY1、CY6)作用后細(xì)菌內(nèi)無超氧自由基產(chǎn)生。在厭氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、M

7、BC濃度的喹賽多作用后細(xì)菌內(nèi)并沒有羥自由基的產(chǎn)生。
　　 在厭氧條件下，自由基清除劑甘露醇、硫脲、二甲亞砜、丙酮、β-巰基乙醇、乙醇、甲醇、疊氮化鈉都可以一定程度抑制喹賽多的抗菌作用，這說明自由基在喹賽多抗菌過程中起到了很重要的作用。在有氧條件下，鈦試劑對0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多的抗菌作用都有較強(qiáng)的抑制作用，隨著鈦試劑濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，這說明在有氧條件下超氧自由基在喹賽多抗菌作用中發(fā)揮著很重要的作用。不同濃

8、度喹賽多作用含質(zhì)粒pUC-19的大腸桿菌2h后，細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒出現(xiàn)了明顯的降解，降解作用隨著時(shí)間的延長和藥物濃度的增加逐漸增強(qiáng)。β-巰基乙醇和疊氮化鈉可以顯著的抑制喹賽多對質(zhì)粒的損傷作用，這說明喹賽多很可能是以芳香族自由基的形式作用于DNA核糖上的C1位引起了DNA的降解。
　　 經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多作用后細(xì)菌的細(xì)胞膜并沒有出現(xiàn)明顯的損傷。通過掃描電鏡觀察在厭氧條件下喹賽多作用的細(xì)菌形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.5MIC、M

9、IC、MBC濃度的喹賽多作用0.5h后細(xì)菌的形態(tài)變化都不是很明顯，為正常的短桿菌狀。在MIC濃度作用4h后，細(xì)菌明顯變長；24h后，細(xì)菌呈現(xiàn)長條狀；48h后，細(xì)菌出現(xiàn)了絲狀，部分細(xì)菌出現(xiàn)了斷裂、破碎、細(xì)胞質(zhì)外泄等癥狀。這種細(xì)菌出現(xiàn)了變長、絲狀的反應(yīng)是細(xì)菌DNA受到損傷時(shí)的特有反應(yīng)。
　　 2.喹賽多在細(xì)菌體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的研究
　　 目前，還沒有對喹噁啉類藥物作用相關(guān)受體進(jìn)行研究的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將采用放射性標(biāo)記的方法研究細(xì)菌內(nèi)

10、是否存在喹賽多作用受體。實(shí)驗(yàn)將從兩個(gè)方面進(jìn)行研究：第一，先將細(xì)菌的亞細(xì)胞片段進(jìn)行分離，使用放射性透析法研究氚標(biāo)記喹賽多是否和亞細(xì)胞組分有結(jié)合；第二，用不同濃度的氚標(biāo)記喹賽多處理大腸桿菌，觀察亞細(xì)胞組分是否會出現(xiàn)受體飽和現(xiàn)象。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用差速離心法建立了細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿的分離方法。不同的亞細(xì)胞組分在0.01、0.1、1μg/ml的氚標(biāo)記喹賽多中透析20h以后，透析袋內(nèi)外放射性比值基本都在1左右，這說明藥物并沒有和細(xì)

11、菌的各亞細(xì)胞組分產(chǎn)生特異性結(jié)合。對氚標(biāo)記喹賽多處理的細(xì)菌進(jìn)行亞細(xì)胞組分分離，發(fā)現(xiàn)喹賽多在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中的分布比例分別為5.89%、16.22%和77.8%，說明藥物主要分布于細(xì)胞漿中。藥物濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/ml的喹賽多作用于細(xì)菌不同時(shí)間后，使用抽濾法對結(jié)合于各種亞細(xì)胞組分中放射活度進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)各種亞細(xì)胞組分中的放射性并沒有隨著藥物濃度的增加出現(xiàn)放射性受體飽和現(xiàn)象，這說明喹賽多進(jìn)入

12、細(xì)菌后并沒有和各亞細(xì)胞組分進(jìn)行特異性的結(jié)合。
　　 綜上所述，喹賽多和其他喹噁啉藥物一樣具有顯著的厭氧選擇活性：在有氧條件下，喹賽多作用后細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生了超氧自由基，超氧自由基是喹賽多發(fā)揮抗菌作用的重要因素之一；在厭氧條件下，喹賽多作用后細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生了一定量的ROS，沒有羥自由基的產(chǎn)生，喹賽多代謝形成的自由基造成的細(xì)菌DNA損傷是喹賽多抗菌作用的原理之一；喹賽多可以引起細(xì)菌形態(tài)的明顯改變；喹賽多在抗菌作用過程中在細(xì)菌體內(nèi)并沒有特定的受