植物發(fā)育突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究在功能基因組時(shí)代發(fā)揮著越來越重要的作用。蛋白質(zhì)組研究旨在研究基因組編碼的整套蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組的研究。目前，基因突變引起的蛋白質(zhì)表達(dá)變化是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。擬南芥和水稻是植物分子生物學(xué)研究中兩種重要的模式植物。本文以新篩選的擬南芥突變體和實(shí)驗(yàn)室已有的水稻突變體為材料，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別研究了它們發(fā)育突變體中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，獲得了以下主要研究結(jié)果。 (1)擬南芥發(fā)育突變體的篩選研究

2、 以擬南芥藍(lán)光受體雙突變體cry1cry2為實(shí)驗(yàn)材料，通過激活標(biāo)簽技術(shù)構(gòu)建了T—DNA插入突變體庫，并從中篩選到6個(gè)與開花時(shí)間有關(guān)和2個(gè)矮化的發(fā)育突變體。采用質(zhì)粒拯救(plasmid rescue)、IPCR(inverse PCR，反向PCR)和TAIL—PCR(Thermal asymmetric interlaced—PCR，熱不對(duì)稱巢式PCR)等方法，分析得出了這些發(fā)育突變體T—DNA插入位點(diǎn)的基因組側(cè)翼序列。通過RT—PC

3、R方法分析了突變體T—DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明突變體表型的變化可能是T—DNA插入后35S強(qiáng)啟動(dòng)子引起附近的基因表達(dá)量增加造成的，從而進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)育突變體的突變分子基礎(chǔ)。通過篩選發(fā)育突變體和鑒定相關(guān)基因，為深入研究植物光周期開花調(diào)控以及下胚軸伸長抑制的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 (2)水稻和擬南芥育性突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 通過雙向電泳、MALDI—TOF質(zhì)譜、MALDI—TOF—TOF質(zhì)譜等技術(shù)比較分析了

4、水稻株1S不育和可育條件下花粉母細(xì)胞形成期，減數(shù)分裂期以及花粉內(nèi)容物充實(shí)期(第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期)的幼穗蛋白的動(dòng)態(tài)變化過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻株1S在不育和可育條件下，分別在幼穗第Ⅴ期有43個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，第Ⅵ期有32個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，第Ⅶ期有23個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。選取其中50個(gè)蛋白用于質(zhì)譜鑒定，最后有20個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定，分析后發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了糖代謝，能量代謝，蛋白質(zhì)的生物合成，細(xì)胞壁形成和脅迫響應(yīng)等與花粉發(fā)育相關(guān)的過程。通過RT—PC

5、R方法對(duì)其中3個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)與相應(yīng)mRNA水平的表達(dá)相一致，另外2個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)與其mRNA水平的表達(dá)不一致，表明后2個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)基因可能由于基因表達(dá)存在翻譯后修飾。我們共得到了8個(gè)與育性相關(guān)的蛋白，其中UDP—葡糖醛酸脫羧酶、咖啡酰輔酶A—氧—甲基轉(zhuǎn)移酶和OSJNBa0060D06.10蛋白與育性轉(zhuǎn)換緊密關(guān)聯(lián)。這些分析結(jié)果表明溫度控制水稻的育性是通過共調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，初步從蛋白質(zhì)

6、水平闡述了溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理。 選取篩選到的擬南芥晚開花突變體scc106—D和對(duì)照材料cry1cry2作為研究對(duì)象，比較了兩者生長在白光下的蛋白質(zhì)水平差異，通過質(zhì)譜分析最后鑒定得到了22個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)其中17個(gè)蛋白在scc106—D突變體中同時(shí)下調(diào)，而另有3個(gè)蛋白僅在cry1cry2中表達(dá)。分析鑒定得到的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，它們主要參與了碳水化合物代謝、能量代謝、硫代謝、光合作用、光呼吸、脅迫響應(yīng)和蛋白質(zhì)的合成

7、等過程，其中光合蛋白占36％，能量相關(guān)蛋白占14％。結(jié)果說明光合速率下降和能量降低可能是使突變體發(fā)育遲緩，開花延遲，育性降低，下胚軸變短的主要原因。這些結(jié)果提示，T—DNA插入后35S強(qiáng)啟動(dòng)子引起附近的基因表達(dá)量增加，在光作用下調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)從而導(dǎo)致突變體表型的變化。 (3)水稻和擬南芥矮化突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 采用雙向電泳技術(shù)分離水稻株1S、矮稈突變體SV14和湘陵628S的莖蛋白，通過質(zhì)譜鑒定得到了33個(gè)差異蛋

8、白質(zhì)點(diǎn)。其中在矮稈突變體SV14中27個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)，1個(gè)僅在SV14中表達(dá)，2個(gè)僅在株1S中表達(dá)：在湘陵628S中25個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)，1個(gè)僅在湘陵628S中表達(dá)，3個(gè)僅在株1S中表達(dá)。通過分析可以將這些差異蛋白分為兩大類：第一類是調(diào)節(jié)性蛋白，如咖啡酸三氧轉(zhuǎn)甲基酶，熱激蛋白70，醛酮變位酶Ⅰ，肌動(dòng)蛋白等，它們主要參與蛋白質(zhì)的合成和加工、脅迫響應(yīng)、細(xì)胞骨架穩(wěn)定等過程；第二類是功能性蛋白，如抗壞血酸過氧化物酶，細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶，細(xì)胞質(zhì)磷酸甘油

9、酸激酶，S—腺苷蛋氨酸合成酶，ATP合酶等，它們則參與氧化還原平衡、光合作用、光呼吸和各種代謝等過程。調(diào)節(jié)性蛋白豐度的下調(diào)可能引起了水稻發(fā)育的遲緩，功能性蛋白活性和豐度的改變，則主要破壞水稻植株細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，兩者共同作用從而最終導(dǎo)致莖變短和植株變矮。該結(jié)果從蛋白質(zhì)表達(dá)水平闡述了水稻植株矮化的內(nèi)在原因，為進(jìn)一步開展水稻矮稈分子育種奠定了基礎(chǔ)。 選取篩選到的矮化突變體scc8—D和對(duì)照材料cry1cry2作為研究對(duì)象，比較了兩者