植物發(fā)育突變體的蛋白質組學研究.pdf

1、蛋白質組學研究在功能基因組時代發(fā)揮著越來越重要的作用。蛋白質組研究旨在研究基因組編碼的整套蛋白質的結構和功能，從而補充轉錄組的研究。目前，基因突變引起的蛋白質表達變化是蛋白質組學研究的重要內(nèi)容。擬南芥和水稻是植物分子生物學研究中兩種重要的模式植物。本文以新篩選的擬南芥突變體和實驗室已有的水稻突變體為材料，利用蛋白質組學方法分別研究了它們發(fā)育突變體中蛋白質表達譜的變化，獲得了以下主要研究結果。 (1)擬南芥發(fā)育突變體的篩選研究

2、 以擬南芥藍光受體雙突變體cry1cry2為實驗材料，通過激活標簽技術構建了T—DNA插入突變體庫，并從中篩選到6個與開花時間有關和2個矮化的發(fā)育突變體。采用質粒拯救(plasmid rescue)、IPCR(inverse PCR，反向PCR)和TAIL—PCR(Thermal asymmetric interlaced—PCR，熱不對稱巢式PCR)等方法，分析得出了這些發(fā)育突變體T—DNA插入位點的基因組側翼序列。通過RT—PC

3、R方法分析了突變體T—DNA插入位點兩側基因的表達情況，結果表明突變體表型的變化可能是T—DNA插入后35S強啟動子引起附近的基因表達量增加造成的，從而進一步證實了這些發(fā)育突變體的突變分子基礎。通過篩選發(fā)育突變體和鑒定相關基因，為深入研究植物光周期開花調控以及下胚軸伸長抑制的機理奠定了基礎。 (2)水稻和擬南芥育性突變體的蛋白質組學研究 通過雙向電泳、MALDI—TOF質譜、MALDI—TOF—TOF質譜等技術比較分析了

4、水稻株1S不育和可育條件下花粉母細胞形成期，減數(shù)分裂期以及花粉內(nèi)容物充實期(第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期)的幼穗蛋白的動態(tài)變化過程。結果發(fā)現(xiàn)水稻株1S在不育和可育條件下，分別在幼穗第Ⅴ期有43個差異蛋白質點，第Ⅵ期有32個差異蛋白質點，第Ⅶ期有23個差異蛋白質點。選取其中50個蛋白用于質譜鑒定，最后有20個差異蛋白質點得到了鑒定，分析后發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了糖代謝，能量代謝，蛋白質的生物合成，細胞壁形成和脅迫響應等與花粉發(fā)育相關的過程。通過RT—PC

5、R方法對其中3個蛋白質對應基因進行表達分析，結果發(fā)現(xiàn)其中1個蛋白質的表達與相應mRNA水平的表達相一致，另外2個蛋白質的表達與其mRNA水平的表達不一致，表明后2個蛋白質對應基因可能由于基因表達存在翻譯后修飾。我們共得到了8個與育性相關的蛋白，其中UDP—葡糖醛酸脫羧酶、咖啡酰輔酶A—氧—甲基轉移酶和OSJNBa0060D06.10蛋白與育性轉換緊密關聯(lián)。這些分析結果表明溫度控制水稻的育性是通過共調節(jié)相關基因的表達而實現(xiàn)的，初步從蛋白質

6、水平闡述了溫敏核不育水稻育性轉換的分子機理。 選取篩選到的擬南芥晚開花突變體scc106—D和對照材料cry1cry2作為研究對象，比較了兩者生長在白光下的蛋白質水平差異，通過質譜分析最后鑒定得到了22個差異蛋白質點，并發(fā)現(xiàn)其中17個蛋白在scc106—D突變體中同時下調，而另有3個蛋白僅在cry1cry2中表達。分析鑒定得到的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，它們主要參與了碳水化合物代謝、能量代謝、硫代謝、光合作用、光呼吸、脅迫響應和蛋白質的合成

7、等過程，其中光合蛋白占36％，能量相關蛋白占14％。結果說明光合速率下降和能量降低可能是使突變體發(fā)育遲緩，開花延遲，育性降低，下胚軸變短的主要原因。這些結果提示，T—DNA插入后35S強啟動子引起附近的基因表達量增加，在光作用下調節(jié)相關基因的表達從而導致突變體表型的變化。 (3)水稻和擬南芥矮化突變體的蛋白質組學研究 采用雙向電泳技術分離水稻株1S、矮稈突變體SV14和湘陵628S的莖蛋白，通過質譜鑒定得到了33個差異蛋

8、白質點。其中在矮稈突變體SV14中27個蛋白點下調，1個僅在SV14中表達，2個僅在株1S中表達：在湘陵628S中25個蛋白點下調，1個僅在湘陵628S中表達，3個僅在株1S中表達。通過分析可以將這些差異蛋白分為兩大類：第一類是調節(jié)性蛋白，如咖啡酸三氧轉甲基酶，熱激蛋白70，醛酮變位酶Ⅰ，肌動蛋白等，它們主要參與蛋白質的合成和加工、脅迫響應、細胞骨架穩(wěn)定等過程；第二類是功能性蛋白，如抗壞血酸過氧化物酶，細胞質蘋果酸脫氫酶，細胞質磷酸甘油

9、酸激酶，S—腺苷蛋氨酸合成酶，ATP合酶等，它們則參與氧化還原平衡、光合作用、光呼吸和各種代謝等過程。調節(jié)性蛋白豐度的下調可能引起了水稻發(fā)育的遲緩，功能性蛋白活性和豐度的改變，則主要破壞水稻植株細胞內(nèi)的代謝平衡，兩者共同作用從而最終導致莖變短和植株變矮。該結果從蛋白質表達水平闡述了水稻植株矮化的內(nèi)在原因，為進一步開展水稻矮稈分子育種奠定了基礎。 選取篩選到的矮化突變體scc8—D和對照材料cry1cry2作為研究對象，比較了兩者