紅麻光鈍感突變體的基因組差異與蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、紅麻(Hibiscus cannabinus L.)為錦葵科木槿屬短日照一年生草本韌皮纖維植物,具有耐環(huán)境脅迫能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、纖維產(chǎn)量高、品質(zhì)好等特性,是我國(guó)麻紡和造紙工業(yè)的重要纖維原料,但其早花混雜品種嚴(yán)重影響了纖維產(chǎn)量,本研究擬以福紅952航天誘變獲得的光鈍感(對(duì)光周期反應(yīng)不敏感)突變體為材料,在海南表現(xiàn)為三種類(lèi)型的突變體:現(xiàn)蕾期幼蕾脫落(GⅠ型)、現(xiàn)蕾不開(kāi)花(GⅡ型)、開(kāi)花不結(jié)實(shí)(GⅢ型),分別從植物生理學(xué)、基因組差異、蛋白質(zhì)組

2、學(xué)研究突變體光鈍感且短光誘導(dǎo)不育的遺傳規(guī)律。研究結(jié)果如下：
　　 ⑴紅麻光周期觀察:紅麻光鈍感突變體2008年冬季在海南自然短日照條件下,155d仍未現(xiàn)蕾開(kāi)花,而正常品種只需120d左右即可現(xiàn)蕾開(kāi)花。2009年7月4日在福州對(duì)紅麻光鈍感突變體材料進(jìn)行12h的短日照處理,結(jié)果表明處理20d后對(duì)照福紅952開(kāi)始現(xiàn)蕾,而突變體30d后開(kāi)始現(xiàn)蕾,即現(xiàn)蕾時(shí)間推遲大約10d左右。
　　 ⑵以紅麻品種福紅952經(jīng)航天誘變獲得的光鈍感突

3、變體與光敏感紅麻細(xì)胞質(zhì)保持系L23B品種雜交,在海南130d短日照條件下誘導(dǎo)了花蕾的分化發(fā)育,即突變體中出現(xiàn)了幼蕾的黃化脫落、現(xiàn)蕾不開(kāi)花、開(kāi)花不結(jié)實(shí)三種類(lèi)型,觀察其分離情況,F2代群體光敏感與光鈍感植株的分離比例為3:1分離,說(shuō)明光鈍感與光敏感性狀存在一對(duì)基因的遺傳差異,光周期鈍感性狀為隱性遺傳,該研究結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)展紅麻光鈍感的基因克隆及分子機(jī)理研究提供重要的遺傳材料。
　　 ⑶分別測(cè)定在人工短日照光周期處理的光鈍感紅麻與對(duì)

4、照福紅952三個(gè)不同時(shí)期的葉片可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果表明,隨著紅麻從一裂葉、三裂葉、五裂葉三個(gè)不同時(shí)期的發(fā)育,葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸均呈現(xiàn)低、高、低的變化規(guī)律,對(duì)照福紅952變化幅度均大于光鈍感植株,表明紅麻光鈍感在光周期誘導(dǎo)下表現(xiàn)出的光周期不敏感特性與其葉片內(nèi)的生理代謝密切相關(guān)。
　　 ⑷從24個(gè)多態(tài)性較好的RAPD引物中篩選到3個(gè)引物可以把紅麻光鈍感突變體與對(duì)照品種區(qū)分開(kāi)來(lái)

5、,獲得4條特異條帶,測(cè)序表明這四個(gè)片段大小分別為612bp、723bp、743bp、1178bp,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)SCAR標(biāo)記奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 ⑸應(yīng)用在其他高等植物開(kāi)發(fā)的8對(duì)mtDNA(線粒體DNA)特異引物,對(duì)紅麻光鈍感突變體線粒體基因非編碼區(qū)DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明選用的8對(duì)引物能擴(kuò)增線粒體基因間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域,并只檢測(cè)到2個(gè)變異位點(diǎn),說(shuō)明mtDNA在紅麻光鈍感突變體與親本之間相當(dāng)保守。
　　 ⑹應(yīng)用8對(duì)

6、cpDNA(葉綠體DNA)通用引物對(duì)紅麻光鈍感突變體及相近的紅麻品種的葉綠體基因組非編碼區(qū)DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。共擴(kuò)增植物cpDNA約13kb,占其葉綠體基因組8.1％。擴(kuò)增產(chǎn)物分別應(yīng)用4種限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ HindⅢ、TaqⅠAulⅠ)酶切,1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果表明:cpDNA在紅麻光鈍感突變體與正常品種比較,均能擴(kuò)增出條帶,大小在1.5kb-2.0Kb之間,說(shuō)明所選用的通用引物可用于紅麻葉綠體基因組DNA研究,將P

7、CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,每個(gè)片段均有相同的酶切位點(diǎn),僅cp4引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用AluⅠ內(nèi)切酶酶切得到多態(tài)片段,但突變體與親本之間未發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組DNA發(fā)生變異。上述結(jié)果表明,紅麻光鈍感突變發(fā)生在基因組DNA上,與線粒體與葉綠體的基因組DNA無(wú)關(guān)。
　　 ⑺以紅麻光周期不敏感(光鈍感)突變體的開(kāi)花期與正常品種福紅952葉片為材料,首先建立并優(yōu)化蛋白質(zhì)雙向電泳研究體系,即采用蛋白質(zhì)雙向電泳(two-dimensional ele

8、ctrophoresis,2-DE)技術(shù),在樣品制備、不同的蛋白質(zhì)上樣量及染色方法等方面進(jìn)行了比較研究,研究結(jié)果表明:(1)紅麻葉片TCA丙酮法比苯酚抽提法提取效率高且蛋白齊全,其中TCA-丙酮法蛋白提取率為20.56％,苯酚抽提法提取效率為4.90％。(2)蛋白質(zhì)干粉的裂解液中加入0.2M硫脲后可以獲得更多的蛋白質(zhì)差異點(diǎn),這些差異點(diǎn)主要為堿性蛋白。(3)分別利用銀染和考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)第二向SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,結(jié)果表明,銀染靈敏

9、度最高,但可重復(fù)性差,考馬斯亮藍(lán)G250比R250染色方法更靈敏,因此建議使用考馬斯亮藍(lán)G250,可以獲得理想的結(jié)果。(4)利用上述改良后的方法提取紅麻福紅952與光鈍感紅麻葉片總蛋白,進(jìn)行雙向電泳,對(duì)染色后的膠體圖片利用PDQUEST軟件進(jìn)一步對(duì)雙向電泳產(chǎn)生的2-DE蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較分析,獲得9個(gè)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),其中2個(gè)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶,質(zhì)體轉(zhuǎn)酮酶,果糖1,6-磷酸醛縮酶,熱激蛋白共5個(gè)點(diǎn)在品種福紅952中出現(xiàn),而在突變