油桐種仁不同發(fā)育時期表達蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、油桐是原產(chǎn)我國的世界著名木本油料樹種，從其種子中提煉而出的桐油是一種性質(zhì)優(yōu)良的干性油，廣泛應(yīng)用于工業(yè)中，具有極高的出口價值。
　　 利用經(jīng)典蛋白質(zhì)組學研究方法成功構(gòu)建出油桐種仁在這一發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)表達譜，最終可運用蛋白質(zhì)表達譜從蛋白質(zhì)水平對油桐種仁中脂肪酸代謝過程進行闡述。發(fā)現(xiàn)油桐種仁中油脂含量與參與脂肪酸代謝的蛋白表達情況密切相關(guān)，油脂含量是由一系列參與脂肪酸代謝的蛋白（酶）共同決定的;此外，油體的動態(tài)發(fā)育過程更加形象化的

2、體現(xiàn)了這一過程。論文為構(gòu)建油桐種仁蛋白質(zhì)表達譜從蛋白質(zhì)水平理解其內(nèi)油脂合成過程，對種仁蛋白質(zhì)的提取、雙向電泳體系優(yōu)化、表達譜分析做了大量研究，得出研究結(jié)論如下:
　　 (1)分析了影響油桐種仁蛋白質(zhì)提純的關(guān)鍵因素，篩選確定TCA-丙酮結(jié)合酚抽法為有效提取油桐種仁蛋白質(zhì)。實驗結(jié)果表明種仁中的內(nèi)含物對油桐種仁蛋白質(zhì)提純影響顯著，采用TCA-丙酮結(jié)合酚抽法能針對油桐種仁中所富含的次生代謝物質(zhì)如核酸、糖、酚類物質(zhì)進行有效清除，故能制備出

3、濃度高達8.1μg/μL的蛋白質(zhì)樣品;其次，SDS-PAGE實驗表明，TCA-丙酮結(jié)合酚抽法對種仁中的高、低分子量蛋白質(zhì)有較強的提取能力;再次， TCA-丙酮結(jié)合酚抽法所制備的蛋白質(zhì)樣品2-DE圖譜分辨率高、背景清晰。
　　 (2)成功構(gòu)建出具有高穩(wěn)定性和高重復(fù)性的油桐種仁蛋白質(zhì)雙向電泳體系。具體針對能影響油桐種仁蛋白質(zhì)雙向電泳效果的蛋白質(zhì)裂解液、上樣量、等電聚焦時間以及SDS-PAGE電泳的運行條件等因素，進行優(yōu)化對比實驗，確

4、定了各因素的最優(yōu)條件。成功構(gòu)建的最優(yōu)油桐種仁蛋白質(zhì)雙向電泳體系為:以TCA-丙酮結(jié)合酚抽法制各樣品后經(jīng)過配方為7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4％ CHAPS、65 mmol/L DTT和2％ IPG buffer的裂解液裂解后，等電聚焦上樣700μg進行聚焦70000Vh能夠得到良好的分離效果。
　　 (3)研究發(fā)現(xiàn)油桐在花后130 d～160 d為其發(fā)育過程中油脂積累的關(guān)鍵時期。通過對油脂含量變化和種殼顏色變化將這一

5、時期劃分為3個不同的發(fā)育階段S1(130 d)、S2(145 d)和S3(160 d)。
　　 (4)在油桐種仁發(fā)育的3個不同階段中共發(fā)現(xiàn)有144個蛋白質(zhì)發(fā)生了差異表達，并通過MALDI-TOF/MS/MS成功鑒定出其中76個，將其分為能量代謝(25％)、脂肪酸代謝(15.79％)、抗性(14.47％)、蛋白酶(11.84％)等11個功能類別。
　　 (5)研究發(fā)現(xiàn)能量代謝一直是油桐種仁發(fā)育過程中除了脂肪酸代謝之外的最主

6、要的生理代謝活動之一，TAC循環(huán)和糖酵解是其主要的代謝途徑。S29(Malate dehydrogenase，蘋果酸脫氫酶)的表達量隨著種仁發(fā)育而逐漸增加，表明TAC循環(huán)中的草酰乙酸再生速度得到提升，而草酰乙酸的再生過程是維持TAC循環(huán)持續(xù)進行的關(guān)鍵。S62（3-phosphoglycerate kinase，3-磷酸甘油酸激酶）表達隨著種仁發(fā)育而增加表明糖酵解代謝隨著發(fā)育而得到增強。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)參與脂肪酸代謝的蛋白質(zhì)在3個時期中的表達

7、變化過程與種仁中油脂的積累速率變化相一致，均是拋物線的變化趨勢，峰值出現(xiàn)在S2時期。這一發(fā)現(xiàn)有助于成功從蛋白質(zhì)水平對種仁中油脂積累變化進行闡述。RT-PCR對參與能量代謝、脂肪酸代謝的10個蛋白質(zhì)的研究結(jié)果表明，基因水平上的表達變化趨勢與蛋白質(zhì)水平的表達變化趨勢具有較高的相似性，表明質(zhì)譜鑒定結(jié)果具有較高的可靠性;同時，RT-PCR結(jié)果也可得出上述(5)(6)的結(jié)論。
　　 (6)在不同的發(fā)育階段，油體有不同的細胞學特征。以此為基