MAP4調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移在子癇前期發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的:
　　子癇前期(pre-eclampsia，PE)是一個(gè)病因未明的復(fù)雜疾病，以母體高血壓、蛋白尿等為特征，約占妊娠婦女的5％-8％[1]。病情嚴(yán)重時(shí)，將導(dǎo)致母親子癇抽搐的發(fā)生以及胎兒宮內(nèi)死亡。唯一確切的治療方式就是胎兒及其附屬物娩出，但卻增加了新生兒早產(chǎn)的發(fā)生率[2]。子癇前期治療效果不佳的癥結(jié)主要是其病因不明，目前的病因?qū)W研究主要集中在滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常及早期胎盤(pán)形成不良。
　　胎盤(pán)形成和胚胎植入是早期妊娠必經(jīng)的過(guò)程，

2、是妊娠延續(xù)中最重要的決定因素之一。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲為胎盤(pán)形成奠定基礎(chǔ)，其侵襲程度決定了胎盤(pán)的穩(wěn)定性和胎盤(pán)與蛻膜結(jié)合的深度。同時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞錨定子宮螺旋動(dòng)脈確保了胎兒有足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足、局部功能障礙，將導(dǎo)致許多嚴(yán)重的產(chǎn)科并發(fā)癥發(fā)生，如流產(chǎn)、子癇前期、胎盤(pán)早剝、死胎等。而滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過(guò)度將導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生，如侵襲性葡萄胎、絨毛膜癌等，對(duì)母體的生命造成傷害。因此，只有胚胎侵襲入母體與母體在這一過(guò)程中的自救相互平衡，

3、胚胎才能得以順利孕育。早期胚胎中染色體核型異常時(shí)，大多數(shù)(90％)都被自然淘汰而流產(chǎn)了，而染色體核型正常的早期胚胎，大多數(shù)(93％)都繼續(xù)妊娠，顯著地體現(xiàn)了胚胎與母體之間的這一平衡[3]。因此，流產(chǎn)是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲失敗的結(jié)局，是自然質(zhì)量控制的結(jié)果。所有影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和錨定在子宮螺旋動(dòng)脈的因素，勢(shì)必決定著胚胎孕育的成敗。
　　滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲受到胞內(nèi)和胞外許多信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)節(jié)，涉及識(shí)別并消化細(xì)胞外基質(zhì)、定向遷移等多個(gè)過(guò)程，其中，滋養(yǎng)

4、細(xì)胞的定向遷移是侵襲行為的關(guān)鍵步驟。
　　與絕大多數(shù)細(xì)胞遷移模式相同，滋養(yǎng)細(xì)胞的定向遷移包括細(xì)胞極化、偽足形成、基質(zhì)粘連、尾部釋放、胞體收縮等多個(gè)環(huán)節(jié)，而細(xì)胞骨架和粘連結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)重組是一個(gè)基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，也是各種因素調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的重要靶點(diǎn)[4,5]。細(xì)胞骨架主要由微管和微絲組成，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)通過(guò)微絲結(jié)構(gòu)重組刺激人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移，而關(guān)于微管與滋養(yǎng)細(xì)胞遷移之間關(guān)系的研究較少。微管是具有極性的中空管狀結(jié)構(gòu)，

5、在細(xì)胞內(nèi)的分布呈束網(wǎng)狀，并構(gòu)成一個(gè)軌道運(yùn)輸系統(tǒng)，多種細(xì)胞物質(zhì)如囊泡、細(xì)胞器等均順著其極性方向移動(dòng)，并且，微管還參與中心粒等的裝配、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分裂等過(guò)程[6，7]。微管骨架穩(wěn)定聚合的調(diào)節(jié)依賴(lài)于一系列結(jié)合于微管內(nèi)、外側(cè)的微管結(jié)合蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，其中MAP4在人滋養(yǎng)細(xì)胞有表達(dá)，是促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞微管穩(wěn)定延長(zhǎng)的正性調(diào)節(jié)因素。微管在胞內(nèi)的穩(wěn)定聚合、延長(zhǎng)方向可以精確地指向細(xì)胞與

6、胞外基質(zhì)粘連的粘著斑部位，微管向粘著斑移動(dòng)與細(xì)胞周?chē)恼持呷芙庥嘘P(guān)。對(duì)于遷移的細(xì)胞，依賴(lài)微管的粘著斑溶解對(duì)于分解細(xì)胞后方粘著斑十分重要[8]。
　　JEG-3細(xì)胞來(lái)源于人絨毛膜癌組織，其形態(tài)、生化標(biāo)志、功能等細(xì)胞特征與絨毛組織原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞最為相似。因此，本實(shí)驗(yàn)用JEG-3細(xì)胞研究人滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和可能機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:缺氧通過(guò)MAP4對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的調(diào)控及機(jī)制的研究
　　1.常氧和低氧培養(yǎng)

7、滋養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)缺氧時(shí)間將細(xì)胞分為五組0h、6h、12h、18h、24h組;
　　2.Transwell法分析滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性遷移能力;
　　3.免疫熒光染色分析滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)微管、黏著斑結(jié)構(gòu)變化;
　　4.Western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化;
　　5.使用EXCEL及SPSS軟件整理數(shù)據(jù)。
　　第二部分:MAP4、細(xì)胞骨架蛋白在子癇前期患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)
　　1.搜集選取第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院

8、（大坪醫(yī)院）產(chǎn)科2013年01月-2014年03月收治的重度子癇前期患者（PE組）20例和正常晚孕患者（control組）20例行擇期剖宮產(chǎn)后的胎盤(pán)組織;
　　2.通過(guò)組織HE染色研究實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胎盤(pán)組織中絨毛和血管的差異;
　　3.通過(guò)組織免疫組化研究胎盤(pán)絨毛組織中相關(guān)分子的定位及表達(dá);
　　4.提取胎盤(pán)絨毛相關(guān)蛋白，行western-blot分析其表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.低氧抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，6

9、h組與0h組比較，侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力進(jìn)一步降低，12h組與0h組、6h組比較，18h組與12h組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　2.隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，MAP4、微管蛋白表達(dá)逐漸降低，微管逐漸解聚、黏著斑逐漸聚合，黏著斑蛋白表達(dá)逐漸增多;
　　3.與正常對(duì)照組相比，PE組胎盤(pán)組織血管痙攣、閉塞、血流量減少;
　　4.與正常對(duì)照組相比，P

10、E組胎盤(pán)組織中微管蛋白和MAP4蛋白表達(dá)較少、黏著斑蛋白表達(dá)較多，與滋養(yǎng)細(xì)胞低氧環(huán)境中表達(dá)一致。
　　結(jié)論:
　　1.低氧環(huán)境中，MAP4的變化可能通過(guò)影響細(xì)胞骨架中微管的聚合和黏著斑的形態(tài)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移;
　　2.PE患者胎盤(pán)組織血管痙攣、閉塞、血流量減少，絨毛發(fā)育不良，可能與局部血管病變有關(guān)，為臨床胎盤(pán)缺血缺氧提供了直接證據(jù)。同時(shí)，PE患者胎盤(pán)組織中MAP4、α-tubulin、vinculin蛋白表達(dá)異常，可能