RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的機(jī)制及子癇前期患者臨床資料分析.pdf

1、目的：
　　子癇前期(preeclampsia，PE)/子癇（eclampsia）一直是嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒健康的產(chǎn)科重癥，其發(fā)病率和致死率均較高，但其發(fā)病原因尚不明確，因此臨床治療多以“對(duì)癥治療”和“適時(shí)終止妊娠”為主要手段，效果不佳。本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分著重對(duì)RhoC/ROCK調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移相關(guān)的微管骨架和黏著斑結(jié)構(gòu)方面的可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。并在臨床資料分析部分還回顧了PE/子癇患者產(chǎn)前或產(chǎn)后1周內(nèi)的腎活檢的病理學(xué)特征

2、和母兒情況。
　　方法：
　　在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分，本研究以人滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3細(xì)胞系為主要研究平臺(tái)，分別構(gòu)建RhoC蛋白的高表達(dá)和低表達(dá)慢病毒載體，并用相應(yīng)的慢病毒包裝感染JEG-3細(xì)胞，在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞RhoC基因的調(diào)控;然后分別利用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同RhoC表達(dá)水平的滋養(yǎng)細(xì)胞固有遷移和水平遷移的能力變化，利用Transwell小室結(jié)合基質(zhì)膠的侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞中不同RhoC蛋白表達(dá)水平

3、對(duì)細(xì)胞侵襲功能的影響，利用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在正常培養(yǎng)和低血清培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細(xì)胞中RhoC表達(dá)變化對(duì)于細(xì)胞增殖的作用;再采用免疫印跡法檢測(cè)RhoC高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞中RhoC下游靶分子ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)微管聚合的MAP4蛋白的表達(dá)差異;為了分析不同RhoC表達(dá)水平的滋養(yǎng)細(xì)胞中微管的聚合和解聚水平，我們先將細(xì)胞中聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)的微管蛋白進(jìn)行分離，再用的免疫印跡分別進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)，同時(shí)還在激光共聚焦掃描

4、顯微鏡下觀察細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的變化情況;最后運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)不同RhoC表達(dá)水平的JEG-3細(xì)胞中黏著斑蛋白的表達(dá)情況，并用激光共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞中黏著斑結(jié)構(gòu)的排列特征。
　　在PE患者臨床資料分析的第一部分中，本研究首先選取2007年1月至2013年12月間在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦共173人，其中輕度子癇前期(mild preeclampsia，mPE)患者53人，重度子癇前期(severe preeclamps

5、ia，sPE)患者42人，正常對(duì)照組孕婦79人。重點(diǎn)排除了既往有腎病史、胰島素依賴型糖尿病、需要甾體激素治療的哮喘、慢性肝炎（無論是否有肝功能異常）、嚴(yán)重的外傷史、服用抗凝藥物史、口服避孕藥物史、吸煙史、特發(fā)性血小板減少性紫癜、HELLP綜合征、妊娠期血小板減少癥或任何類型的血液系統(tǒng)疾病的患者。分別收集每名患者早孕期和晚孕期凝血功能和血小板參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果，再對(duì)其進(jìn)行對(duì)比和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組別之間的正態(tài)分布變量差異的顯著性采用單因素方差分

6、析多重比較，對(duì)于非參數(shù)變量則采用Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)并進(jìn)行post-hoc分析。比較同一患者不同孕期的相同參數(shù)使用配對(duì)檢驗(yàn)，其中正態(tài)分布變量采用Fisher's LSD法，而非參變量采用Wilcoxon法。最后采用使用受試者工作特征(receiver-operating characteristic，ROC)曲線評(píng)估每一項(xiàng)參數(shù)預(yù)測(cè)PE發(fā)病和嚴(yán)重程度的實(shí)際效能，并利用二進(jìn)制回歸分析評(píng)價(jià)篩選出的指標(biāo)對(duì)PE的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　

7、　在PE患者臨床資料分析的第二部分中，本研究回顧了從2007年1月至2012年1月間，因病情進(jìn)展或診治需要于妊娠期或分娩后7日內(nèi)在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腎臟內(nèi)科進(jìn)行超聲引導(dǎo)下的細(xì)針經(jīng)皮腎穿刺活檢的sPE/子癇患者，共8例。所有患者均排除了糖尿病史、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史、慢性高血壓病史、腎病病史或近期出現(xiàn)的尿路感染。對(duì)這些患者的臨床特點(diǎn)、母兒結(jié)局、母體主要血清學(xué)指標(biāo)，并重點(diǎn)觀察和分析了其腎臟病理切片和免疫熒光特征。
　　結(jié)果：
　

8、?。ㄒ唬┘?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分
　　1.本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)、RNA干擾技術(shù)結(jié)合基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了RhoC高表達(dá)和RhoC干擾慢病毒載體，并利用這兩種慢病毒的包裝成功高效感染293T細(xì)胞模型和JEG-3滋養(yǎng)細(xì)胞，并鑒定和篩選出RhoC持續(xù)高表達(dá)和持續(xù)低表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JEG-3滋養(yǎng)細(xì)胞株，其RhoC蛋白表達(dá)水平分別顯著高于和低于空載體病毒感染組的滋養(yǎng)細(xì)胞和正常對(duì)照組滋養(yǎng)細(xì)胞。
　　2.在正常細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，滋養(yǎng)細(xì)胞中RhoC

9、蛋白表達(dá)水平升高可顯著提高細(xì)胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖能力，而RhoC蛋白表達(dá)降低則可顯著抑制細(xì)胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖的能力;但在低血清培養(yǎng)條件下，滋養(yǎng)細(xì)胞中RhoC的表達(dá)水平并不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖造成顯著影響。
　　3.在滋養(yǎng)細(xì)胞中，RhoC下游的靶分子ROCKⅠ和ROCKⅡ的蛋白表達(dá)水平與RhoC蛋白表達(dá)高度一致，提示RhoC在細(xì)胞內(nèi)可能通過促進(jìn)ROCKⅠ和ROCKⅡ分子的表達(dá)和作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng);而在滋養(yǎng)細(xì)胞

10、中，MAP4蛋白的表達(dá)與ROCKⅠ和ROCKⅡ的變化高度一致，提示RhoC可能通過ROCKⅠ和ROCKⅡ?qū)AP4的磷酸化而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控。
　　4.在滋養(yǎng)細(xì)胞中，RhoC蛋白可以對(duì)微管的聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，RhoC表達(dá)升高后聚合狀態(tài)微管蛋白顯著增多而游離狀態(tài)微管蛋白顯著減少，微管的結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上聚合增強(qiáng)，排列有序;RhoC表達(dá)降低后胞內(nèi)游離狀態(tài)的微管蛋白水平上調(diào)而聚合狀態(tài)的微管蛋白水平下調(diào)，微管結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上趨于解

11、聚，排列紊亂。
　　5.在滋養(yǎng)細(xì)胞中，RhoC蛋白表達(dá)與黏著斑蛋白的水平變化相反，RhoC上調(diào)后黏著斑蛋白表達(dá)降低，在形態(tài)學(xué)上黏著斑的結(jié)構(gòu)解離增強(qiáng);RhoC下調(diào)后黏著斑蛋白表達(dá)升高，在形態(tài)學(xué)上黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)增強(qiáng)。
　　（二）PE患者臨床資料分析一
　　1.正常孕婦晚孕期活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間(thrombi

12、n time，TT)水平較早孕期降低，而纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）水平升高，表現(xiàn)出生理性的高凝狀態(tài);晚孕期血小板計(jì)數(shù)(platelet count，Pt Count)水平較早孕期下降而MPV升高，可能是由血小板聚集和消耗以及繼發(fā)性血小板再生所引起。
　　2.PE患者在孕晚期出現(xiàn)了超高凝的狀態(tài)，其微血管中微血栓的形成和纖維蛋白的大量產(chǎn)生及繼發(fā)性溶解導(dǎo)致血小板和FIB的大量消耗，PE特別是sPE患者孕晚期出現(xiàn)APTT和

13、TT延長(zhǎng)以及D-二聚體和平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)的升高，提示其體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)源性和外源性凝血途徑的嚴(yán)重紊亂。
　　3.MPV是早期預(yù)測(cè)PE的理想指標(biāo)（以MPV＞8.95fL為入選標(biāo)準(zhǔn)），也是預(yù)測(cè)PE嚴(yán)重程度的重要潛在標(biāo)志（以MPV＞9.95fL為入選標(biāo)準(zhǔn)）。
　?。ㄈ㏄E患者臨床資料分析二
　　1.PE/子癇患者腎臟活檢常見的病理特征包括:內(nèi)皮增生、足細(xì)胞空泡形成、腎小球系膜細(xì)

14、胞增殖和腎小管管腔的蛋白管型;
　　2.補(bǔ)體成分(C4)和免疫球蛋白(IgM)的沉積，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷;
　　3.BUN/SCr比值有成為sPE標(biāo)志物的潛力;
　　4.子癇可以發(fā)生于血壓稍高于正常范圍（135/93mmHg）的患者，在臨床工作中必須引起高度的重視;
　　5.妊娠期間的腎活檢僅推薦用于確診和改進(jìn)治療策略，并應(yīng)根據(jù)患者的一般條件，包括血壓和凝血功能等情況酌情實(shí)施。
　　結(jié)論:
　　(1

15、) RhoC對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的固有遷移、水平遷移和侵襲能力具有調(diào)控作用，其主要機(jī)制是通過激活下游靶蛋白R(shí)OCKⅠ和ROCKⅡ來調(diào)節(jié)MAP4分子的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞微管骨架的聚合和黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。這些結(jié)果為深入闡明Rho亞家族蛋白調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的細(xì)胞骨架相關(guān)機(jī)制奠定了一定的研究基礎(chǔ)，也為開發(fā)新的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)而對(duì)PE的發(fā)生進(jìn)行早期預(yù)防提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　(2)正常妊娠晚期孕婦凝血-纖溶系統(tǒng)處于生理性的高凝狀態(tài)，表現(xiàn)為血

16、小板數(shù)量的消耗和生成的激活;PE患者的內(nèi)源性和外源性凝血途徑均發(fā)生嚴(yán)重紊亂而出現(xiàn)超高凝的狀態(tài)，同時(shí)消耗了血小板和纖維蛋白原，造成患者多器官病變和出血傾向，導(dǎo)致PE發(fā)病或進(jìn)一步加重病情;MPV可作為PE發(fā)病和嚴(yán)重程度的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。這些結(jié)果為PE的凝血特點(diǎn)研究及早期預(yù)測(cè)研究奠定了初步的基礎(chǔ)。
　　(3)內(nèi)皮增生、足細(xì)胞空泡變性、腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小管腔的蛋白管型是PE/子癇患者腎活檢的主要病理表現(xiàn)，C4和IgM的沉積可能是PE患