兒童腎母細胞瘤中自噬抑制及其意義探討.pdf

1、目的：
　　腎母細胞瘤又稱腎胚胎瘤或Wilm氏瘤，是最常見的腹部惡性腫瘤，其發(fā)病率在小兒腹部腫瘤中占首位，占兒科惡性腫瘤的6％。根據文獻報道，腎母細胞瘤中存在Bcl-2表達升高，p53變異，以及β-catenin激活，已知這幾種分子均可通過調控自噬參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，故推測腎母細胞瘤存在自噬失調。細胞自噬是一種主要由溶酶體介導的細胞對內容物自我降解的過程，是細胞維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護性機制，但過度自噬對細胞有殺傷作用，已經被

2、納入為一種腫瘤的特征性活動。目前尚無關于自噬和腎母細胞瘤關系的相關報道。本研究探究腎母細胞瘤中自噬的特征性變化，自噬調控如何影響腎母細胞瘤增殖，意在進一步闡釋腎母細胞瘤發(fā)病機理，并探索是否可以通過調控自噬水平，提出比傳統(tǒng)治療方案更高效低毒的抑瘤方案。
　　材料和方法：
　　本研究采用細胞系G401（ATCC購進），組織標本采集:所有標本來自浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院組織標本庫。所涉及的自噬調控藥物以及化療藥物3-MA、CQ、

3、Rapamycin、VCR來自Sigma, Cayman等試劑公司，。所用特異性抗體以及HRP標記二抗:p62，Beclin1，LC3來自MBL，Sigma，Santa Crus，Invitrogen等試劑公司。
　　1.了解腎母細胞瘤中的自噬水平。組織層面:RT-PCR法檢測化療后腎母細胞瘤組織以及癌旁相對正常腎組織中自噬相關基因LC3，BECLIN1，P62和ATG5mRNA水平的表達;應用免疫組化方法檢測化療前后，腎母細胞瘤

4、組織以及癌旁相對正常腎組織LC3、Beclin1，p62蛋白水平的變化，以及耐藥腫瘤組織中上述三種蛋白的表達;Western-blotting檢測化療后腎母細胞瘤組織以及癌旁相對正常腎組織中自噬蛋白p62，Beclin1，LC3的水平。
　　2.明確自噬調控能否協(xié)同常規(guī)化療藥(VCR)殺傷腎母細胞瘤細胞。選取腎母細胞瘤細胞G401，使用MTT法檢測細胞活力。明確單用各自噬調控藥物（CQ/3-MA/rapamycin）以及單用化療藥

5、物對G401的生長抑制，比較聯(lián)用自噬調控藥物后常規(guī)化療藥對目的細胞殺傷效用的影響（與化療藥拮抗或者協(xié)同或疊加）。
　　3.分析自噬調控藥物（CQ/3-MA/rapamycin）以及化療藥(VCR)如何影響G401細胞自噬。選取合理的藥物劑量，處理細胞24小時，用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，Western-blotting檢測自噬蛋白p62，LC3水平，分析有效調控劑量。
　　4.進一步驗證自噬抑制是否影響腫瘤生長

6、，以及藥物作用是否通過自噬。應用慢病毒(帶有GFP-SiRNA-ATG7)瞬時轉染G401，有效下調ATG7后，用不同濃度的自噬誘導藥物rapamycin，比較ATG7表達抑制組與對照組中rapamycin對細胞生長的抑制程度。
　　結果：
　　1.組織層面:Q-PCR結果顯示，相較于癌旁組織，癌組織:BECLIN1/P62/ATG5/ LC3基因mRNA水平表達均增高（△CT根據三次實驗結果用mean±SE法表示，通過T檢

7、驗分析，P＜0.05視為統(tǒng)計學差異具有顯著性）。Western-blotting結果顯示，相較于癌旁相對正常組織，治療后癌組織Beclin1蛋白無明顯改變，p62堆積，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ增多。免疫組化半定量結果顯示:治療前的癌組織較正常組織Beclin1，p62，LC3蛋白表達均低，其中Beclin1顯著。治療后（化療）癌組織Beclin1，p62，LC3水平均回升，且化療耐藥癌組織Beclin1，p62，LC3亦呈高水平。
　　

8、2.細胞層面:1.VCR20 nM能產生對G401細胞50％左右的抑制率，而繼續(xù)增加VCR濃度不能顯著提高細胞抑制率。2.自噬抑制藥物(3-MA/CQ)對G401有殺傷作用，小劑量有效;自噬激動劑rapamycin對G401亦有殺傷作用但抑制率不高，最大抑制率約為20％。3.VCR（20 nM）聯(lián)用自噬抑制藥物(3-MA/CQ)以后，對G401的殺傷作用并無協(xié)同殺傷作用，甚至拮抗;而聯(lián)用自噬誘導藥物rapamycin后，對G401的殺傷

9、明顯提升，低劑量時聯(lián)用協(xié)同作用最強。4.Western-blotting結果顯示，在G401中，3-MA有效抑制自噬（上游）劑量為0.5mM; CQ有效抑制自噬（下游）劑量為10μM; Rapamycin有效促進自噬（上游）劑量為1μM;0-50 nM VCR對自噬并無明顯調控作用。
　　3.自噬相關基因干擾:慢病毒（轉染所需）本身對G401細胞生長有一定抑制作用。在此基礎上，在下調ATG7以后，細胞生長進一步受到抑制，而rapa

10、mycin對ATG7敲減的G401的生長抑制比對照組明顯減弱。
　　結論：
　　1.未化療兒童腎母細胞瘤普遍存在自噬抑制，化療有激活自噬的作用，但對腫瘤細胞具有抑制作用或保護作用未知。自噬激活可能參與化療抵抗。
　　2.自噬抑制（CQ/3-MA與siRNA ATG7）可顯著殺傷腎母細胞瘤細胞G401，自噬誘導（Rapamycin）對G401也有一定殺傷作用。
　　3.自噬抑制藥物(CQ/3-MA)聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥V