線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體對神經(jīng)母細胞瘤細胞自噬和線粒體自噬的作用.pdf

1、腦缺血再灌注損傷能夠引起神經(jīng)細胞損傷，導致細胞凋亡或壞死，引起缺血區(qū)腦組織神經(jīng)功能失調(diào)。自噬是細胞內(nèi)的各種基質(zhì)和細胞器通過溶酶體系統(tǒng)降解的過程，它是促進細胞在各種壓力環(huán)境下存活的重要功能。線粒體既是細胞內(nèi)能量供應(yīng)的主要細胞器，也是活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生的主要來源，同時也是細胞缺氧再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷的重要作用靶點。I/R損傷導致細胞內(nèi)ROS含量增

2、加，細胞器受損并導致線粒體功能障礙，受損的線粒體最終通過線粒體自噬途徑被選擇性的清除。因此，線粒體自噬在線粒體質(zhì)量控制和細胞存活中具有重要的作用，及時清除受損傷的線粒體對細胞對抗I/R損傷具有重要的意義。大量研究證明，線粒體自噬功能受損或過度激活均與細胞死亡有關(guān)。通過線粒體自噬途徑及時清除受損傷的線粒體對神經(jīng)細胞的存活是有益的，而過度激活的自噬往往會清除細胞內(nèi)大量的重要細胞器，如線粒體，造成細胞損傷，并最終導致細胞發(fā)生自噬性死亡。

3、>　　線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體（mitochondrial calcium uniporter, MCU）是線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運的重要通道，而鈣離子對線粒體自噬具有重要的調(diào)控作用。在純化的線粒體體外實驗中已經(jīng)證明，MCU能夠調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）的開放，而MPTP在誘導線粒體自噬方面具有重要的調(diào)控作用。另一方面，線粒體是一個動態(tài)的細胞器，不斷的進行

4、著分裂和融合活動。線粒體分裂能夠產(chǎn)生兩個不同代謝水平的子線粒體，具有正常膜電位的健康線粒體能夠繼續(xù)參與線粒體的分裂和融合活動，而膜電位較低的子線粒體往往通過線粒體自噬途徑而降解、清除，因此，線粒體分裂會促進線粒體自噬的發(fā)生，可能是線粒體自噬所必需的上游事件。有趣的是，MCU能夠調(diào)控線粒體的分裂和融合，通過抑制線粒體分裂或促進線粒體融合能夠抑制線粒體自噬的發(fā)生。抑制線粒體分裂，能夠降低海馬神經(jīng)元中ROS的含量，下調(diào)線粒體分裂蛋白Drp1、

5、細胞色素C(cytochrome, CytC)和促凋亡蛋白Bax的表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達并提高Bcl-2/Bax蛋白比值，通過減少細胞凋亡途徑而減輕海馬神經(jīng)元缺氧復氧損傷。由于凋亡和自噬之間存在著復雜的聯(lián)系，盡管MCU對細胞自噬和線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用仍不確切，我們猜測MCU與細胞自噬和線粒體自噬之間也存在著緊密的聯(lián)系，并且能夠決定神經(jīng)細胞的最終命運。
　　目的：研究I/R損傷對神經(jīng)細胞自噬和線粒體自噬水平的影響，探討

6、MCU對I/R損傷誘導的細胞自噬和線粒體自噬的調(diào)控作用。
　　方法：通過建立神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的氧糖剝奪再灌注（oxygen and glucose deprivation/reperfusion, OGD/RP）損傷細胞模型來模擬腦I/R損傷。實驗細胞隨機分為6組：（1）正常對照組：細胞在正常條件下培養(yǎng)未經(jīng)任何處理；（2）OGD/RP組：細胞經(jīng)過OGD處理6小時后，恢復正常培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育24小時；（3）

7、　　OGD/RP+RU360組：細胞在OGD前加入Ruthenium360（RU360）(10μm)共同孵育30分鐘，OGD后恢復正常培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育24小時；（4）OGD/RP+Sper組：細胞在OGD前加入精胺（Sper）(10μm)孵育30分鐘，OGD后恢復正常培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育24小時；（5）RU360組：細胞與RU360(10μm)共同孵育30分鐘，然后恢復正常培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育24小時；（6）Sper組:：細胞與Sper(10μ

8、m)共同孵育30分鐘，然后恢復正常培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育24小時。采用cell counting kit-8試劑盒（CCK-8）法檢測各組細胞的活性，JC-1線粒體膜電位試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potentia, MMP），透射電鏡（transmission electron microscopy, TEM）檢測各組細胞的超顯微結(jié)構(gòu)，Western blot法檢測各組細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白

9、P62、Tom20、Beclin-1的表達水平。數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：細胞活性檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，OGD/RP組、OGD/RP+RU360組和OGD/RP+Sper組細胞活性明顯下降（P＜0.001）；與OGD/RP組比較，OGD/RP+RU360組細胞活性明顯升高（P＜0.001），OGD/

10、RP+Sper組無顯著性差異（P＞0.05）；RU360組和Sper組細胞活性與對照組比較結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。TEM檢測結(jié)果顯示：OGD/RP組、OGD/RP+RU360組和OGD/RP+Sper組細胞內(nèi)線粒體明顯腫脹，能夠檢測到典型的自噬體或線粒體自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，線粒體數(shù)量較對照組明顯減少；與OGD/RP組比較，OGD/RP+RU360組線粒體腫脹明顯減輕，線粒體形態(tài)較完整；RU360組和Sper組細胞線粒體形態(tài)較對照組

11、無明顯差異。MMP檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，OGD/RP組、OGD/RP+RU360組和OGD/RP+Sper組MMP明顯降低（P＜0.001）；與OGD/RP組比較，OGD/RP+RU360組MMP明顯升高（P＜0.001），OGD/RP+Sper組無顯著性差異（P＞0.05）；RU360組和Sper組MMP與對照組比較結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。蛋白印跡結(jié)果顯示：與對照組比較，OGD/RP組、OGD/RP+RU360組和OG

12、D/RP+Sper組P62、Tom20表達水平明顯下降，Beclin-1表達水平明顯增高（P＜0.001）；與OGD/RP組比較，OGD/RP+RU360組P62、Tom20表達水平明顯增高，Beclin-1表達水平明顯下降（P＜0.001），OGD/RP+Sper組各蛋白表達水平無明顯變化；RU360組和Sper組各蛋白表達水平較對照組無明顯變化。
　　結(jié)論：1、OGD/RP損傷誘導了SH-SY5Y細胞自噬和線粒體自噬的發(fā)生。<