蜀葵小孢子母細胞中自噬活動的研究.pdf

1、自噬（Autophagy，AP）是真核生物將細胞內冗余或受損傷的蛋白質及細胞器用雙層膜包裹運往液泡或溶酶體中降解再利用的過程，在生物體正常發(fā)育、衰老或遭受生物、非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。關于自噬的研究早期主要集中在酵母和哺乳動物，近些年來在植物中的研究逐漸增多，但主要局限于在生物和非生物脅迫條件下的細胞的自噬，另外還局限于植物的營養(yǎng)生長過程，對正常生長發(fā)育過程中，尤其是植物的生殖過程中的自噬還鮮有研究。之前本實驗室在透射電鏡下觀察發(fā)

2、現(xiàn)蜀葵和油菜減數(shù)分裂期小孢子母細胞內存在復雜的類自噬體結構，但它們是否代表真正的自噬體以及它們的形成機制和功能還不清楚。為此，本研究以蜀葵為材料，通過自噬特異性染色劑MDC染色、自噬抑制劑3-MA和E-64預處理以及亞顯微結構觀察，對蜀葵小孢子母細胞（MMCs）中的自噬現(xiàn)象做了進一步定性的研究。主要結果如下：
　　（1）MDC染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常生長條件下的早期和減數(shù)分裂期MMCs細胞質呈綠色或藍色熒光，其內分布有數(shù)量不

3、等的藍色亮點，這些亮點即代表自噬體，這些亮點主要分布在細胞邊緣，有些亮點在細胞邊緣聚集成大的亮斑。減數(shù)分裂期MMCs內亮點的數(shù)目明顯多于早期MMCs。小孢子時期亮點消失。
　?。?）3-MA預處理24h和36h之后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞質呈綠色熒光，但自噬體數(shù)目比正常組細胞（不經(jīng)任何處理的細胞）稍有增多，但與DMSO對照組相比顯著減少。DMSO對照組與正常組細胞相比，細胞內自噬體數(shù)目顯著增多。
　?。?）E-64預處理24

4、h和36h之后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞呈藍色或綠色熒光，細胞內自噬體數(shù)目比正常組細胞和DMSO對照組細胞內的自噬體數(shù)目顯著增多。DMSO對照組細胞內自噬體數(shù)目與正常組細胞相比也明顯增多。
　?。?）普通熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常條件下的小孢子體積較小，大小均一。3-MA預處理后，大部分（70％）小孢子體積相對變大，大小變得不均勻；相反，E-64預處理后，大部分（80%）小孢子體積變小，大小也變得不均一。
　?。?）RT-PCR

5、檢測發(fā)現(xiàn)，自噬相關基因ATG8在蜀葵根、莖、葉、小孢子母細胞、四分體、小孢子中都有表達。
　?。?）亞顯微結構觀察顯示，早期蜀葵MMCs內的確有典型的自噬體結構存在。其形成過程有：細胞內先出現(xiàn)新月狀雙層膜結構，這種結構的膜繼續(xù)延伸形成杯狀，最后膜兩端融合形成自噬體結構，并將一些受損細胞器及蛋白包裹在內。隨著細胞的發(fā)育，部分自噬體被周圍另外的膜包裹形成多層膜結構；部分自噬體內膜斷裂并卷曲，形成胞內體。最后，部分自噬體與質膜融合，將內