轉(zhuǎn)錄因子HOXC9在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用及其對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控研究.pdf

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性程度高的膠質(zhì)瘤，擁有很強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力。約占全部顱內(nèi)腫瘤的12～15%，由于腫瘤與正常的腦組織之間沒(méi)有特別明顯的邊界，手術(shù)方法也不能將其完全切除，又因其發(fā)生于顱腔中，常規(guī)的放療和化療對(duì)殘留的腫瘤細(xì)胞殺傷能力有限，所以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的生存狀況一直得不到很好的改善，患者的平均壽命僅為15個(gè)月左右，只有5%的患者壽命能夠延續(xù)5年以上，多數(shù)患者仍然死于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)。因此深入了

2、解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病及惡化的分子機(jī)制，推動(dòng)其預(yù)防和治療手段的發(fā)展迫在眉睫。
　　轉(zhuǎn)錄因子HOXC9（Homeobox C9）是同源異形框（Homeobox，HOX）家族的成員之一，主要在胚胎發(fā)育及成體細(xì)胞分化過(guò)程中提供前后軸定位信息的作用。近年來(lái)有報(bào)道顯示HOXC9基因的表達(dá)異?？赡芘c一些腫瘤的形成有關(guān)，因此闡明其與腫瘤之間的關(guān)系可能為腫瘤的治療提供新的思路。而HOXC9基因與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。本項(xiàng)

3、目就此展開(kāi)研究探討HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人預(yù)后的影響，及其對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、成瘤、遷移、侵襲能力的影響，并對(duì)HOXC9調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供新的生物學(xué)理論和分子基礎(chǔ)。本研究目前取得的研究成果如下：
　?。?）HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的影響及其表達(dá)分析
　　為了研究HOXC9在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中擔(dān)任什么角色，它的表達(dá)量是否與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的預(yù)后相關(guān)，我們首先通過(guò)利用R2

4、:Genomics Analysis and Visualization Platform平臺(tái)上的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)膠質(zhì)瘤病人預(yù)后和HOXC9表達(dá)量之間的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，HOXC9的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后密切相關(guān)。HOXC9表達(dá)量高，病人預(yù)后差，生存率低；HOXC9表達(dá)量低，病人預(yù)后好，生存率高。由此可見(jiàn)，HOXC9的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后密切相關(guān)。
　　膠質(zhì)瘤的預(yù)后與其臨床分級(jí)有關(guān)，分級(jí)越高，患者的預(yù)后越差。我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)

5、提供的數(shù)據(jù)對(duì)不同分級(jí)膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達(dá)量進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達(dá)量要高于正常膠質(zhì)細(xì)胞，這暗示著HOXC9可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程。此外，并且隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的提高，HOXC9的表達(dá)量也隨之提高，二者存在正相關(guān)，這暗示著HOXC9可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程。我們還發(fā)現(xiàn)，在不同分級(jí)膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達(dá)量也與病人的預(yù)后密切相關(guān)。HOXC9表達(dá)量高，病人預(yù)后差，生存率低；HOXC9表達(dá)量低，病人預(yù)后好，生存率高。

6、>　　隨后，我們用免疫印跡四個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中HOXC9蛋白的表達(dá)量做了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HOXC9在四個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中普遍表達(dá)。A172的惡性程度在四個(gè)細(xì)胞系中相對(duì)較低，沒(méi)有成瘤能力，而它的HOXC9蛋白的表達(dá)量在四個(gè)細(xì)胞系中也相對(duì)較低，這暗示著HOXC9的表達(dá)量與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度可能存在一定的相關(guān)性。此外，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）和免疫印跡（Western Blot）

7、檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床樣本及其癌旁組織中HOXC9的表達(dá)量。從結(jié)果我們可以看到，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中HOXC9的表達(dá)水平要明顯高于其癌旁組織，這說(shuō)明HOXC9可能參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生過(guò)程。
　?。?）HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移侵襲能力的影響
　　為了研究下調(diào)HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖能力的影響，我們利用慢病毒介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)在三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系里干擾 HOXC9基因的表達(dá)。在下調(diào)HOXC9表達(dá)之后，我們從顯微

8、鏡觀察到三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)目要明顯少于對(duì)照組，我們通過(guò)血球計(jì)數(shù)板分別對(duì)兩組細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也與上述類似。這暗示著下調(diào)HOXC9會(huì)影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力。此外，我們用MTT法和BrdU法比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖能力。MTT法檢測(cè)顯示三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞的增殖能力都在下調(diào)HOXC9之后發(fā)生了明顯的下降。免疫熒光檢測(cè)及陽(yáng)性信號(hào)統(tǒng)計(jì)顯示實(shí)驗(yàn)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目要明少于對(duì)照組，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在進(jìn)行

9、DNA復(fù)制的細(xì)胞減少，這也從另一個(gè)角度說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱。
　　為了研究下調(diào)HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力有沒(méi)有影響，我們首先進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。從兩個(gè)細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，HOXC9干擾組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的劃痕愈合能力要明顯弱于對(duì)照組，這說(shuō)明HOXC9干擾組細(xì)胞的遷移能力被削弱。隨后，我們又進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HOXC9下調(diào)組在相同時(shí)間內(nèi)穿膜的細(xì)胞數(shù)要明顯

10、少于對(duì)照組。這再次說(shuō)明HOXC9在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移能力中發(fā)揮重要作用。為了檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力是否受到影響，我們進(jìn)行了基質(zhì)膠（Matrigel）Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系下調(diào)HOXC9組穿過(guò)含有基質(zhì)膠的Transwell小室的能力要明顯比對(duì)照組弱。這說(shuō)明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲能力在下調(diào)HOXC9之后受到了抑制。
　?。?）HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬的影響及其調(diào)控機(jī)制
　　通過(guò)流式細(xì)胞儀和

11、Western Blot方法檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在干擾HOXC9之后并沒(méi)有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們向細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)可以表達(dá)帶綠色熒光標(biāo)簽GFP的LC3B蛋白的載體。從對(duì)三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中我們都觀察到，shHOXC9組細(xì)胞在發(fā)生自噬；而Control組細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生自噬。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western Blot檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HOXC9之后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬增強(qiáng)了。
　　為了研究為何

12、在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中下調(diào)HOXC9會(huì)引發(fā)細(xì)胞自噬，我們通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出8個(gè)候選可能參與調(diào)控自噬的基因。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，在下調(diào)HOXC9之后，DAPK1基因的mRNA表達(dá)量顯著升高。我們把DAPK1作為潛在的重要下游靶標(biāo)又進(jìn)一步在三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系里面檢測(cè)他的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，三個(gè)細(xì)胞系shHOXC9組DAPK1蛋白的表達(dá)水平明顯高于Control組。DAPK1只有在其第308位絲氨酸沒(méi)有被磷酸化時(shí)才能夠激活

13、細(xì)胞自噬，因此，我們通過(guò)Western Blot對(duì)兩個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的pSer308-DAPK1進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，在下調(diào)HOXC9之后pSer308-DAPK1的量并沒(méi)有增多，而DAPK1的總量發(fā)生了明顯的上升，這說(shuō)明308位絲氨酸沒(méi)有被磷酸化的DAPK1蛋白量相對(duì)升高，也就是說(shuō)能夠激活細(xì)胞自噬的DAPK1蛋白發(fā)生上調(diào)，從而增強(qiáng)細(xì)胞自噬。我們把皮下成瘤的樣本拿來(lái)檢測(cè)得到了類似的結(jié)果。接著，我們構(gòu)建了DAPK1 shRNA慢病

14、毒載體，在三個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中下調(diào)HOXC9誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后下調(diào)DAPK1基因的表達(dá)。通過(guò)Western Blot檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，三個(gè)細(xì)胞系下調(diào)DAPK1組細(xì)胞自噬明顯減弱。DAPK1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬需要通過(guò)下游因子Beclin1介導(dǎo)，于是為了了解干擾HOXC9誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是否是通過(guò)DAPK1-Beclin1通路，我們構(gòu)建了Beclin1 shRNA慢病毒載體。在兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中干擾HOXC9誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后，下調(diào)Beclin1的表

15、達(dá)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們觀察到，下調(diào)Beclin1組比起對(duì)照組的自噬要明顯減弱。于是我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明干擾HOXC9誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬主要是通過(guò)激活DAPK1-Beclin1這條通路。
　　為了了解HOXC9是如何調(diào)控DAPK1基因的表達(dá)，我們首先對(duì)DAPK1的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析。我們克隆了5個(gè)長(zhǎng)度不同DAPK1啟動(dòng)子片段并將其插入pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告載體上，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，-1121~-368這段序列可能擁

16、有能被某些轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合的微點(diǎn)存在。HOXC9通常作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控基因表達(dá)，為了了解HOXC9是否是DAPK1的轉(zhuǎn)錄抑制子，我們進(jìn)行了染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)我們檢測(cè)到HOXC9在DAPK1啟動(dòng)子-528～-412bp處有較高結(jié)合。有意思的是P2區(qū)域剛好落在-1121～-368之間，這暗示著HOXC9是通過(guò)結(jié)合到DAPK1啟動(dòng)子-528～-412bp處抑制DAPK1基因的表達(dá)。過(guò)去曾有報(bào)道HOXC9可以特異的識(shí)別并

17、結(jié)合ATTTAT序列，通過(guò)對(duì)DAPK1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-528～-412bp序列進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)了一段ATTTAT序列位于-442～-437之間。以上數(shù)據(jù)表明，HOXC9是通過(guò)結(jié)合到DAPK1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-442～-437序列來(lái)抑制DAPK1基因的表達(dá)。
　　（4）HOXC9對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞成瘤能力的影響
　　為了了解下調(diào)HOXC9是否對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的克隆形成能力有影響，我們用兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行了體外的軟瓊脂

18、克隆形成實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們觀察到，兩個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系shHOXC9組形成的克隆大小比Control組要小，而且形成克隆的數(shù)目也比對(duì)照組要少。這說(shuō)明干擾HOXC9的表達(dá)影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的克隆形成能力。為了了解干擾HOXC9是否對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的體內(nèi)成瘤能力有影響，我們做了小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。我們用到兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，注射于小鼠背部靠臀側(cè)，左側(cè)臀注射Control細(xì)胞，右側(cè)臀注射shHOXC9細(xì)胞。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看到，干擾HOX