反轉(zhuǎn)錄病毒介導的過表達miR-21對肝癌細胞干樣生物學特性的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建microRNA-21(miR-21)反轉(zhuǎn)錄病毒過表達載體，通過轉(zhuǎn)染肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細胞系MHCC-97H，獲得穩(wěn)定上調(diào)miR-21的細胞株。探討miR-21與肝癌干細胞(livercancer stem cell，LCSCs)之間的關系及其可能的作用機制，以及對細胞克隆、侵襲、轉(zhuǎn)移以及裸鼠成瘤能力的影響。
　　方法:1.設計miR-21前體引物，PCR擴增目的基因，通

2、過提取目的基因和質(zhì)粒DNA、雙酶切、T-A連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞等構(gòu)建pBABE-puro-pre-miR-21反轉(zhuǎn)錄病毒載體和空白對照質(zhì)粒。將其與包裝質(zhì)?；旌瞎厕D(zhuǎn)染293T細胞，產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒液。
　　2.取對數(shù)生長期MHCC-97H細胞接種于六孔板中，分為兩組:感染pBABE-puro-pre-miR-21反轉(zhuǎn)錄病毒過表達載體作為實驗組(pre-miR-21組);感染慢病毒空載體作為對照組(NC組)。使用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基連續(xù)

3、培養(yǎng)實驗組和對照組細胞兩個月，收集兩組細胞。相對定量PCR法檢測兩組細胞miR-21表達量。
　　3.利用相對定量PCR檢測干細胞標志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4mRNA表達量變化，Western Blot檢測干細胞標志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4蛋白水平的表達。
　　4.通過平板克隆實驗和Transwell法分別檢測miR-21過表達后MHCC-97H的成瘤和侵襲能力的變化。
　　5.

4、取pre-miR-21組和NC組細胞接種裸鼠皮下。觀察成瘤情況、瘤體生長情況，繪制腫瘤生長曲線;34天后測定腫瘤最終體積和重量。
　　結(jié)果:1.成功包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pBABE-puro-pre-miR-21和空載質(zhì)粒pBABE-puro-NC的病毒液。
　　2.轉(zhuǎn)染后pBABE-puro-pre-miR-21組細胞miR-21表達量相對于空載組細胞上升了（7.78±1.51）倍，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。獲得

5、了miR-21過表達的穩(wěn)定的細胞株。
　　3.與NC組相比較，干細胞標志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4的mRNA在pre-miR-21組表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);干細胞標志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4蛋白在pre-miR-21組表達明顯升高，同時差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.肝癌細胞系MHCC-97H過表達miR-21后的平板克隆的CFE為(24.8±3.1)％

6、，明顯高于NC組細胞(15.3±3.6)％，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026＜0.05)。培養(yǎng)24小時后遷移實驗中遷移至Transwell膜背面的細胞數(shù)為:NC組，(104.8±6.5)/HP; pre-miR-21組，(210.3±5.8)/HP。pre-miR-21組遷移細胞數(shù)顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);細胞侵襲到膜背面的細胞數(shù)分別為:NC組，(56.7±2.5)/HP; pre-miR-21組，(107.3

7、±2.3)/HP，顯著高于NC組(P＜0.001)。
　　5.pre-miR-21組和NC組均在接種第5天出現(xiàn)肉眼可見的瘤體。第20天開始，NC組相對于pre-miR-21組瘤體生長的相對緩慢一些，兩組相比較差異有統(tǒng)計學意義。第34天處死裸鼠后，發(fā)現(xiàn)pre-miR-21組瘤體體積大小為（773.62±163.46）(mm3)明顯大于NC組（502.79±33.94）(mm3)，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.048＜0.05）。裸鼠飼養(yǎng)