逆轉(zhuǎn)錄病毒介導反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘毎挠绊?pdf

1、目的：研究逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘毎囊种谱饔?，探討通過抑制端粒酶活性治療肝細胞癌的有效途徑。 方法：常規(guī)方法進行質(zhì)粒提取，采用紫外分光光度計測定所提取質(zhì)粒的濃度和純度，并通過電穿孔法將攜帶正義和反義端粒酶RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達載體質(zhì)粒導入PT67包裝細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒細胞株，分別命名為PT67-hTR～EooRI和PT67-hTR-BamHI：待細胞生長至對數(shù)生長期，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒

2、上清，超速離心獲得濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用NIH3T3細胞檢測所收集逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度：用濃縮后的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HepG2肝癌細胞，G418篩選4周獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞克隆，分別命名為HepG2-hTR-EcoRI和HepG2-hTR-BamHI;挑取單個細胞克隆擴增培養(yǎng)，利用擴增端粒酶RNA基因的引物進行PCR鑒定：通過MTT法分別檢測轉(zhuǎn)染正義和反義端粒酶RNA基因組肝癌細胞(HepG2-hTR～EcDRI和HepG2-hTR-B

3、amHI)以及未轉(zhuǎn)染端粒酶RNA基因組肝癌細胞(HepG2)的生長曲線，并分析反義端粒酶RNA基因與化療藥物(5-氟尿嘧啶和順鉑)對于肝癌細胞的協(xié)同抑制作用：免疫熒光化學檢測不同處理組肝癌細胞抗中性粒細胞核抗原(PCNA)的表達情況；TRAP-PCR-ELISA法檢測各組細胞的端粒酶活性：流式細胞術檢測細胞所處的細胞周期及凋亡率的改變。 結果：PCR鑒定可于約500 bp處檢測到目的基因的表達，證明基因轉(zhuǎn)染成功：所收集的濃縮逆轉(zhuǎn)

4、錄病毒滴度分別為0.95×10<'6>CFU/ml和1.1×10<'6>CFU/ml：反義端粒酶RNA基因治療組肝癌細胞生長受到明顯抑制，生長曲線較為平緩，細胞對順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)分別為1.53μg/ml和3.41μg/ml，而對照組的半數(shù)抑制濃度分別為2.83μg/ml和6.44μg/ml，兩者差別明顯：轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA基因組細胞的抗中性粒細胞核增殖抗原(PCNA)表達減少：

5、端粒酶活性檢測結果顯示試驗組細胞的吸光密度值為(2.31±0.16)，較作為對照的轉(zhuǎn)染正義端粒酶RNA基因的HepG2-hTR-EcoRI組細胞及未轉(zhuǎn)染端粒酶RNA基因的HepG2組細胞明顯下降(P<0.01)；流式細胞術檢測結果示試驗組細胞的凋亡率為(9.58±1.38)﹪，與對照組相比差別具有顯著性(P<0.01)，且試驗組肝癌細胞可見G<,2>/M期阻滯及凋亡峰。 結論：端粒酶RNA(hTR)是端粒酶活性的一個重要組成部分