RMP的回復(fù)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：
　　 為進(jìn)一步研究研究RMP(RPB5—mediating protein)功能制備其多克隆抗體，并通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法回復(fù)穩(wěn)定干擾細(xì)胞株中RMP的表達(dá)，研究RMP對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC—7721生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：
　　 1．RMP多克隆抗體的制備。
　　 2．Western blot檢測(cè)所制備的多克隆抗體特異性。
　　 3．采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法分別將真核表達(dá)質(zhì)粒pFLAG—

2、CMV—4—RMP及空載體pFLAG—CMV—4轉(zhuǎn)入穩(wěn)定干擾RMP的肝癌細(xì)胞株。利用RT—PCR和Westernblot檢測(cè)目的基因在各細(xì)胞株中RNA及蛋白的表達(dá)。
　　 4．MTT法檢測(cè)各細(xì)胞株的增殖變化。
　　 5．MTT法檢測(cè)各細(xì)胞株的黏附能力。
　　 6．體外劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　 7．Transwell檢測(cè)各細(xì)胞株的侵襲能力。
　　 8．經(jīng)60Coγ射線輻照后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相

3、應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各細(xì)胞株周期及凋亡的變化。
　　 9．RT—PCR法檢測(cè)與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過(guò)SDS—PAGE法確定含有RMP蛋白短突變體GST—D1相比GST—D3、GST—D5、GST—D9和GST—D10表達(dá)量最高，所制備的多克隆抗體具有最高的抗原抗體反應(yīng)性，純化融合蛋白后免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，WesternBlot顯示抗體具有一定的特異性。
　　 2．脂質(zhì)體介

4、導(dǎo)的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾細(xì)胞株，經(jīng)RT—PCR及Western blot確認(rèn)了RMP在穩(wěn)定干擾細(xì)胞株中回復(fù)表達(dá)。
　　 3．通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示RMP可以促進(jìn)SMMC—7721細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)降低細(xì)胞的粘附能力。
　　 4．劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RMP可促使細(xì)胞的遷移能力增加。
　　 5．Transwell結(jié)果顯示RMP促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力增加。
　　 6．經(jīng)60Coγ射線誘導(dǎo)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)

5、胞周期和凋亡，隨著時(shí)間點(diǎn)推移，與對(duì)照組相比G2期阻滯逐漸降低，細(xì)胞凋亡減少。
　　 7．RT—PCR方法檢測(cè)顯示促凋亡基因Bax和Caspase3表達(dá)下調(diào)，凋亡抑制基因Bcl—2表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)和純化了GST融合蛋白，制備了RMP多克隆抗體并成功用于Western Blot。RMP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC—7721的生長(zhǎng)，降低細(xì)胞的黏附能力、促進(jìn)細(xì)胞的遷移并提高細(xì)胞的