川芎嗪誘導SH-SY5Y細胞向神經元分化及機制研究.pdf

1、神經退行性疾病和神經元損傷是神經系統(tǒng)常見病。此類疾病的預后與神經細胞的存活、神經元分化和功能恢復密切相關，亦與相關基因表達的激活或抑制有關。拓撲異構酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ，TopoⅡβ)是促進神經發(fā)育和神經元分化的關鍵蛋白質。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的一種活性生物堿，化學名2，3，5，6-四甲基吡嗪。最近有研究報道了其對神經干細胞向神經元分化有促進作用，但

2、其確切作用機制尚不明了。本研究以人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞為神經元分化模型，用TMP誘導其向神經元分化，并檢測細胞分化過程中TopoⅡβ的表達變化;進而探討TMP誘導神經元分化的分子機制。為TMP在神經系統(tǒng)疾病相關研究與治療中的應用提供依據。本研究共分三部分。
　　第一部分 川芎嗪對SH-SY5Y細胞生長特性的影響和神經元分化的誘導作用
　　目的:研究TMP對SH-SY5Y細胞生長狀況的影響，以及誘導其向神經元分化的作

3、用。
　　方法:1、細胞培養(yǎng)。2、MTT法檢測SH-SY5Y細胞體外增殖活性，繪制細胞生長曲線。3、乳酸脫氫酶釋放實驗。4、細胞周期和凋亡率檢測。5、細胞核DAPI染色。6、Caspase-3活性檢測。7、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。8、免疫印跡檢測神經元分化標志蛋白MAP2、tau的表達和p21蛋白的表達。
　　結果:1.隨著TMP濃度的增高和培養(yǎng)時間的延長，其對細胞增殖的抑制逐漸增加。提示TMP對SH-SY5Y細胞

4、增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性。
　　2.低濃度TMP(40，80和120μmol/L)對SH-SY5Y細胞無明顯細胞毒性。
　　3.TMP處理后，Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。顯示80μmol/L TMP在誘導SH-SY5Y細胞神經元分化中未導致細胞凋亡。
　　4.在20μmol/L TMP作用下，SH-SY5Y細胞突起長度和分化百分率改變不明顯(P＞

5、0.05)。而40μmol/L誘導2天，細胞突起開始出現明顯增長，與對照細胞比較有顯著性差異(P＜0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP誘導SH-SY5Y細胞后，細胞神經突起長度和分化百分率均較對照細胞明顯增長，且均比40μmol/L誘導后突起長度增加明顯(P＜0.05)。
　　5.采用神經元分化標志分子，微管相關蛋白2和tau蛋白鑒定神經元分化。SH-SY5Y細胞經80μmol/LTMP誘導0，3和5日后MAP

6、2和tau蛋白表達增高，與對照組細胞相比有明顯差異(P＜0.05)。
　　結論:80μmol/L TMP誘導可使SH-SY5Y細胞脫離細胞周期，并向神經元分化;且未見明顯的細胞毒性。因此，本研究選用80μmol/L TMP誘導神經元分化，并繼續(xù)用于后繼機制研究。
　　第二部分 川芎嗪上調TopoⅡβ誘導SH-SY5Y細胞分化的表觀遺傳學機制
　　目的:檢測TMP誘導SH-SY5Y細胞分化過程中，TopoⅡβ的表達變化及

7、其表觀遺傳學機制。
　　方法:1、細胞培養(yǎng)。2、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。3、Western blot檢測TopoⅡα、TopoⅡβ、組蛋白H3、H4、乙酰化組蛋白H3和乙?；M蛋白H4的表達。4、逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測TopoⅡβmRNA表達。5、染色質免疫沉淀技術檢測Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集與結合。
　　結果:1.與對照細胞比較，TMP誘導分化細胞的TopoⅡα蛋白表達在第

8、3天和第5天均明顯減少(P＜0.05);而TopoⅡβ蛋白表達則明顯增加(P＜0.05)。
　　2.與對照細胞相比，TopoⅡβmRNA的表達在TMP誘導分化的第3天和第5天均表現為增加(P＜0.05)。
　　3.TopoⅡβ抑制劑ICRF-193作用后，TopoⅡβ和MAP2蛋白表達受到抑制(P＜0.05);神經突起數量和長度均明顯下降(P＜0.05)。表明TopoⅡβ與神經元分化呈正相關。
　　4.Ac-H3的表達

9、在TMP誘導分化的第3天和第5天逐漸增加(P＜0.05);而Ac-H4的表達在TMP誘導分化的第5天明顯增加(P＜0.05)。提示Ac-H3與Ac-H4均可被TMP誘導表達，而Ac-H3表達升高相對較早。
　　5.ChIP檢測顯示，TMP誘導SH-SY5Y細胞向神經元分化過程中，隨著誘導分化時間的延長，特異性結合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Ac-H3與Ac-H4逐漸增高(P＜0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結合早

10、于Ac-H4。提示Ac-H3發(fā)揮作用早于Ac-H4。
　　結論:TMP誘導神經元分化作用與TopoⅡβ表達的上調有關。TMP促進Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集而誘導TopoⅡβ高表達，是促進神經元分化的重要機制。
　　第三部分 PI3K/Akt信號通路參與川芎嗪誘導SH-SY5Y細胞神經元分化
　　目的:探討TMP誘導SH-SY5Y細胞向神經元分化過程中，PI3K/Akt和ERK1/2信號通路對

11、TopoⅡβ表達和神經元分化的影響及機制。
　　方法:1、細胞培養(yǎng)。2、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。3、Western blot檢測蛋白質表達。4、RT-PCR檢測TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表達。5、ChIP檢測轉錄因子Sp1與NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結合。
　　結果:1.TMP對p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表達的影響
　　80μmol/L

12、 TMP誘導SH-SY5Y細胞分化0，1，3和5天。TopoⅡα蛋白的表達逐漸減少，TopoⅡβ蛋白表達逐漸增多;p-Akt的表達逐漸升高(P＜0.05)，p-ERK1/2表達無明顯變化(P＞0.05);Sp1的表達逐漸增高(P＜0.05)，而NF-YA蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。
　　2.PI3K/Akt抑制劑LY294002對p-Akt，TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表達的影響
　　應用LY294002

13、后，80μmol/L TMP誘導細胞分化5天，TopoⅡα蛋白的表達減少，且不受LY294002的影響;TopoⅡβ和Sp1蛋白表達和p-Akt的表達受到明顯抑制(P＜0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表達無明顯變化(P＞0.05)。
　　3.LY294002抑制TMP誘導的神經突起的發(fā)生和神經元分化標志蛋白的表達
　　TMP誘導第5天，應用LY294002后，TMP誘導細胞的突起長度由150.97±6.62μm

14、下降為91.80±7.82μm（P＜0.05），細胞分化百分率由80.04±3.26％下降為46.20±33.56％（P＜0.05）。而MEK/ERK抑制劑U0126對細胞形態(tài)、細胞突起長度和分化百分率均未產生明顯作用(P＞0.05)。經LY294002處理細胞后，神經元分化標志蛋白MAP2的表達受到明顯抑制(P＜0.05)。而U0126對MAP2蛋白表達未產生明顯抑制作用。表明PI3K/Akt信號通路參與了TMP誘導的SH-SY5Y細

15、胞分化。
　　4.LY294002對TMP誘導TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表達的影響
　　TMP可上調TopoⅡβmRNA的表達，而抑制TopoⅡαmRNA的表達。與TMP誘導組相比較，加入PI3K/Akt抑制劑LY294002作用后，TopoⅡβ mRNA的表達下調(P＜0.05)，而TopoⅡαmRNA的表達無明顯改變(P＞0.05)。分別應用蛋白質合成抑制劑亞胺環(huán)己酮(Cycloheximide，CHX)和RNA

16、聚合酶Ⅱ抑制劑鵝膏菌素（α-amanitin）預處理SH-SY5Y細胞后檢測TopoⅡβ mRNA的表達，結果顯示:α-amanitin(50μg/mL)可明顯降低TMP誘導的TopoⅡβmRNA的表達，而CHX(10 mmol/L)則對其表達無明顯影響。表明TMP上調TopoⅡβ的表達發(fā)生在轉錄水平，并且與PI3K/Akt信號途徑的激活有關。
　　5.TMP誘導轉錄因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)結合
　　

17、ChIP檢測顯示，TMP誘導SH-SY5Y細胞向神經元分化過程中，Sp1蛋白特異性結合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒，促進了TopoⅡβ的轉錄表達。而加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002作用后，結合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Sp1蛋白受到明顯抑制(P＜0.05)。轉錄因子NF-Y的亞型NF-YA在神經分化后期與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結合也呈現增高(P＜0.05)，而LY294002對NF-YA與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)