轉(zhuǎn)錄因子Sp1調(diào)控TopoⅡβ在SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化中的表達.pdf

1、目的：應用全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)誘導入神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY-5Y細胞分化；并探討其向神經(jīng)元分化過程中拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ，TopoⅡ)，即TopoⅡα，β的表達情況；進一步研究轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白1(Specificity proteinl，Sp1)對TopoⅡβ基因表達調(diào)控的影響，以期深入了解神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的作用機制。
　　方法：
　　1細胞

2、培養(yǎng)
　　SH-SY-5Y細胞用含10％胎牛血清、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2 ATRA對SH-SY-5Y細胞作用濃度的篩選
　　不同濃度的ATRA(1，5，10，25，50，100μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細胞后，應用四甲基偶氮唑藍(Methyl

3、thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測定細胞光密度值(Optical density，OD)，計算生長抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，做出生長曲線，從而篩選ATRA對SH-SY-5Y細胞的作用濃度。
　　3 SH-SY-5Y細胞分化百分率的檢測
　　不同濃度的ATRA(1，5，10，25，50μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細胞后，用倒置顯微鏡觀察各組細胞細胞數(shù)目、胞體直徑和突起長度的變化，用圖

4、像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量各組細胞誘導前后的變化。神經(jīng)干細胞分化標準為軸突延伸超過胞體直徑二倍以上，觀察時對每瓶細胞隨機選取5個不同視野共計200個細胞，計算細胞分化百分率。
　　4細胞形態(tài)學觀察
　　倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，檢測細胞分化情況。分為兩組：①正常對照組，傳代后正常培養(yǎng)細胞，并在培養(yǎng)基中加入與誘導分化組ATRA相同濃度的二甲基亞砜(Dimethyl-sulfoxide，DMSO)，

5、即10μmol/LDMSO。②誘導分化組，傳代后換為條件培養(yǎng)基(含3％FBS、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，并在培養(yǎng)基中加入10μmol/L ATRA。兩組細胞在不同時間點(6h，24h，72h，120h)用倒置顯微鏡觀察各組細胞細胞數(shù)目、胞體直徑和突起長度的變化，用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量各組細胞誘導前后的變化。觀察時對每瓶細胞隨機選取5個不同視野共計200個細胞。

6、
　　5細胞周期觀察
　?、僬T導分化組：傳代后換條件培養(yǎng)液(含3％FBS、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，并在培養(yǎng)基中加入10μmol/LATRA，培養(yǎng)72h后收細胞。②正常對照：傳代后正常培養(yǎng)細胞，并在培養(yǎng)基中加入與誘導組ATRA相同濃度的DMSO，即10μmol/L DMSO，培養(yǎng)3d后收細胞。用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
　　6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Revers tr

7、anscription PCR，RT-PCR)
　　RT-PCR半定量檢測Sp1，TopoⅡα，TopoⅡβ mRNA在ATRA誘導細胞分化過程中的變化，并用計算機圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。
　　7 Western blot檢測
　　Western blot檢測各組細胞神經(jīng)元分化標記物，微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein2，MAP2)，Sp1，TopoⅡα，TopoⅡβ蛋白在

8、SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中的表達變化，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定并計算各蛋白條帶的積分光密度同對應β-actin積分光密度比值。
　　8染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)
　　檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1是否特異性結(jié)合于TopoⅡβ基因啟動子GC盒，并對提取純化的DNA應用RT-PCR進行定量分析。
　　結(jié)果：
　　1 SH-SY-5Y細胞呈貼壁、簇狀生長；

9、胞體小而圓，少數(shù)呈梭形，大多數(shù)為不規(guī)則的多邊形，伸出多個較短的神經(jīng)突起。
　　2 MTT結(jié)果顯示，不同濃度的ATRA(1、5、10、25、50、100μmol/L)作用于SH-SY-5Y細胞24h、48h、72h、96h、120h后可以抑制細胞的增殖，在lμmol/L～25μmol/L濃度范圍內(nèi)隨ATRA濃度的增加，抑制作用逐漸加強，且隨著ATRA作用時間的延長，抑制作用也逐漸加強，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

10、ATRA濃度為50μmol/L和100μmol/L誘導細胞分化時，總細胞數(shù)明顯減少。實驗結(jié)果說明，ATRA對SH-SY-5Y細胞的抑制作用在1μmol/L～25μmol/L內(nèi)呈時間-劑量依賴關(guān)系。根據(jù)不同藥物濃度下的OD值，繪制了細胞生長曲線。應用半數(shù)抑制濃度(IC50)計算軟件計算藥物ATRA對SH-SY-5Y細胞的IC50：第24h為34.259±2.183μmol/L；第48h為19.621±1.540μmol/L；第72h為10

11、.330±0.942μmol/L；第96h為7.876±0.625μmol/L；第120h為5.706±0.490μmol/L。
　　3細胞分化百分率檢測結(jié)果顯示，ATRA誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中，5、10、25μmol/L ATRA在誘導分化第6～72h細胞分化百分率逐漸增加，其中，10μmol/L ATRA在誘導分化的第72h，細胞分化百分率達到最高(78.540±2.037％)，即誘導分化為神經(jīng)元的細胞數(shù)目

12、最多。因此，本文選用10μmol/L ATRA作用濃度，誘導細胞向神經(jīng)元分化，并繼續(xù)進行下列實驗研究。
　　4細胞分化形態(tài)學觀察與對照相比，誘導分化第6h，ATRA誘導分化組細胞數(shù)目和神經(jīng)突起長度無明顯變化；誘導分化第72h，細胞數(shù)目減少，胞體聚集生長，具有多個細長神經(jīng)突起，且長度明顯增長，交織成網(wǎng)，具備成熟神經(jīng)元形態(tài)，誘導組各時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5流式細胞儀檢測細胞周期顯示，SH-SY

13、-5Y細胞經(jīng)10μmol/LATRA誘導分化72h后，與正常對照組相比，G0/G1期細胞增加25.2％，G2/M期細胞降低24.7％，細胞增殖指數(shù)PI降低25.2％，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞周期的變化說明，大多數(shù)細胞處于G0/G1期，細胞增殖受到明顯抑制。
　　6 RT-PCR結(jié)果顯示，TopoⅡα mRNA的表達在ATRA誘導分化的第6～72h逐漸減少；而Sp1與TopoⅡβ mRNA的表達在ATRA

14、誘導分化的第6～72h逐漸增加。培養(yǎng)基中加入Sp1的特異性抑制劑光輝霉素(MithramycinA)作用后，Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ mRNA均出現(xiàn)表達下調(diào)。
　　7 Western blot結(jié)果顯示，在向神經(jīng)元誘導分化過程中，神經(jīng)元特異標記蛋白MAP2的表達逐漸增加，分化至72h表達量最高。TopoⅡα僅蛋白的表達在ATRA誘導分化的第6～72h逐漸減少；而Sp1與TopoⅡβ蛋白的表達在ATRA誘導分化的第6～72h

15、逐漸增加。培養(yǎng)基中加入MithramycinA作用后，Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白質(zhì)均出現(xiàn)表達下調(diào)。
　　8染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果顯示，ATRA誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中，隨著誘導分化時間的進行，特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒的Sp1蛋白表達逐漸增高。同時，培養(yǎng)基中加入Sp1特異性抑制劑MithramycinA作用后，特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒的Sp1蛋白表達逐漸降低。結(jié)果顯示，SH-

16、SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中，Sp1可促進TopoⅡβ基因表達。
　　結(jié)論：
　　1應用ATRA可誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化，結(jié)果顯示5、10、25μmol/L ATRA在誘導分化第6～72h細胞分化百分率逐漸增加，其中，10μmol/L ATRA在誘導分化的第72h，細胞分化百分率達到最高。
　　2 SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中，細胞周期的變化說明大多數(shù)細胞被阻滯于G0/G1期，G2/M期細胞

17、顯著降低，細胞增殖受到明顯抑制，TopoⅡα mRNA及其蛋白的表達逐漸減低與細胞的增殖受到抑制有關(guān)。TopoⅡα的表達水平與細胞的分化程度呈反比。
　　3 SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中，Sp1，TopoⅡβ的mRNA及其蛋白的表達逐漸增加與神經(jīng)干細胞的分化密切相關(guān)，TopoⅡβ的表達水平與細胞的分化程度呈正比，即表達高者神經(jīng)元分化程度高。
　　4轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過特異性的結(jié)合TopoⅡβ基因啟動子的GC盒，上調(diào)T