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文檔簡介
1、目的:應用全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)誘導入神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY-5Y細胞分化;并探討其向神經(jīng)元分化過程中拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,TopoⅡ),即TopoⅡα,β的表達情況;進一步研究轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白1(Specificity proteinl,Sp1)對TopoⅡβ基因表達調(diào)控的影響,以期深入了解神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的作用機制。
方法:
1細胞
2、培養(yǎng)
SH-SY-5Y細胞用含10%胎牛血清、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2 ATRA對SH-SY-5Y細胞作用濃度的篩選
不同濃度的ATRA(1,5,10,25,50,100μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細胞后,應用四甲基偶氮唑藍(Methyl
3、thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法測定細胞光密度值(Optical density,OD),計算生長抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50),做出生長曲線,從而篩選ATRA對SH-SY-5Y細胞的作用濃度。
3 SH-SY-5Y細胞分化百分率的檢測
不同濃度的ATRA(1,5,10,25,50μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細胞后,用倒置顯微鏡觀察各組細胞細胞數(shù)目、胞體直徑和突起長度的變化,用圖
4、像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量各組細胞誘導前后的變化。神經(jīng)干細胞分化標準為軸突延伸超過胞體直徑二倍以上,觀察時對每瓶細胞隨機選取5個不同視野共計200個細胞,計算細胞分化百分率。
4細胞形態(tài)學觀察
倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變,檢測細胞分化情況。分為兩組:①正常對照組,傳代后正常培養(yǎng)細胞,并在培養(yǎng)基中加入與誘導分化組ATRA相同濃度的二甲基亞砜(Dimethyl-sulfoxide,DMSO),
5、即10μmol/LDMSO。②誘導分化組,傳代后換為條件培養(yǎng)基(含3%FBS、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液),并在培養(yǎng)基中加入10μmol/L ATRA。兩組細胞在不同時間點(6h,24h,72h,120h)用倒置顯微鏡觀察各組細胞細胞數(shù)目、胞體直徑和突起長度的變化,用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量各組細胞誘導前后的變化。觀察時對每瓶細胞隨機選取5個不同視野共計200個細胞。
6、
5細胞周期觀察
?、僬T導分化組:傳代后換條件培養(yǎng)液(含3%FBS、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液),并在培養(yǎng)基中加入10μmol/LATRA,培養(yǎng)72h后收細胞。②正常對照:傳代后正常培養(yǎng)細胞,并在培養(yǎng)基中加入與誘導組ATRA相同濃度的DMSO,即10μmol/L DMSO,培養(yǎng)3d后收細胞。用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Revers tr
7、anscription PCR,RT-PCR)
RT-PCR半定量檢測Sp1,TopoⅡα,TopoⅡβ mRNA在ATRA誘導細胞分化過程中的變化,并用計算機圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。
7 Western blot檢測
Western blot檢測各組細胞神經(jīng)元分化標記物,微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein2,MAP2),Sp1,TopoⅡα,TopoⅡβ蛋白在
8、SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中的表達變化,并用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定并計算各蛋白條帶的積分光密度同對應β-actin積分光密度比值。
8染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)
檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1是否特異性結(jié)合于TopoⅡβ基因啟動子GC盒,并對提取純化的DNA應用RT-PCR進行定量分析。
結(jié)果:
1 SH-SY-5Y細胞呈貼壁、簇狀生長;
9、胞體小而圓,少數(shù)呈梭形,大多數(shù)為不規(guī)則的多邊形,伸出多個較短的神經(jīng)突起。
2 MTT結(jié)果顯示,不同濃度的ATRA(1、5、10、25、50、100μmol/L)作用于SH-SY-5Y細胞24h、48h、72h、96h、120h后可以抑制細胞的增殖,在lμmol/L~25μmol/L濃度范圍內(nèi)隨ATRA濃度的增加,抑制作用逐漸加強,且隨著ATRA作用時間的延長,抑制作用也逐漸加強,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
10、ATRA濃度為50μmol/L和100μmol/L誘導細胞分化時,總細胞數(shù)明顯減少。實驗結(jié)果說明,ATRA對SH-SY-5Y細胞的抑制作用在1μmol/L~25μmol/L內(nèi)呈時間-劑量依賴關(guān)系。根據(jù)不同藥物濃度下的OD值,繪制了細胞生長曲線。應用半數(shù)抑制濃度(IC50)計算軟件計算藥物ATRA對SH-SY-5Y細胞的IC50:第24h為34.259±2.183μmol/L;第48h為19.621±1.540μmol/L;第72h為10
11、.330±0.942μmol/L;第96h為7.876±0.625μmol/L;第120h為5.706±0.490μmol/L。
3細胞分化百分率檢測結(jié)果顯示,ATRA誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,5、10、25μmol/L ATRA在誘導分化第6~72h細胞分化百分率逐漸增加,其中,10μmol/L ATRA在誘導分化的第72h,細胞分化百分率達到最高(78.540±2.037%),即誘導分化為神經(jīng)元的細胞數(shù)目
12、最多。因此,本文選用10μmol/L ATRA作用濃度,誘導細胞向神經(jīng)元分化,并繼續(xù)進行下列實驗研究。
4細胞分化形態(tài)學觀察與對照相比,誘導分化第6h,ATRA誘導分化組細胞數(shù)目和神經(jīng)突起長度無明顯變化;誘導分化第72h,細胞數(shù)目減少,胞體聚集生長,具有多個細長神經(jīng)突起,且長度明顯增長,交織成網(wǎng),具備成熟神經(jīng)元形態(tài),誘導組各時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
5流式細胞儀檢測細胞周期顯示,SH-SY
13、-5Y細胞經(jīng)10μmol/LATRA誘導分化72h后,與正常對照組相比,G0/G1期細胞增加25.2%,G2/M期細胞降低24.7%,細胞增殖指數(shù)PI降低25.2%,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞周期的變化說明,大多數(shù)細胞處于G0/G1期,細胞增殖受到明顯抑制。
6 RT-PCR結(jié)果顯示,TopoⅡα mRNA的表達在ATRA誘導分化的第6~72h逐漸減少;而Sp1與TopoⅡβ mRNA的表達在ATRA
14、誘導分化的第6~72h逐漸增加。培養(yǎng)基中加入Sp1的特異性抑制劑光輝霉素(MithramycinA)作用后,Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ mRNA均出現(xiàn)表達下調(diào)。
7 Western blot結(jié)果顯示,在向神經(jīng)元誘導分化過程中,神經(jīng)元特異標記蛋白MAP2的表達逐漸增加,分化至72h表達量最高。TopoⅡα僅蛋白的表達在ATRA誘導分化的第6~72h逐漸減少;而Sp1與TopoⅡβ蛋白的表達在ATRA誘導分化的第6~72h
15、逐漸增加。培養(yǎng)基中加入MithramycinA作用后,Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白質(zhì)均出現(xiàn)表達下調(diào)。
8染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果顯示,ATRA誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,隨著誘導分化時間的進行,特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒的Sp1蛋白表達逐漸增高。同時,培養(yǎng)基中加入Sp1特異性抑制劑MithramycinA作用后,特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒的Sp1蛋白表達逐漸降低。結(jié)果顯示,SH-
16、SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,Sp1可促進TopoⅡβ基因表達。
結(jié)論:
1應用ATRA可誘導SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化,結(jié)果顯示5、10、25μmol/L ATRA在誘導分化第6~72h細胞分化百分率逐漸增加,其中,10μmol/L ATRA在誘導分化的第72h,細胞分化百分率達到最高。
2 SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,細胞周期的變化說明大多數(shù)細胞被阻滯于G0/G1期,G2/M期細胞
17、顯著降低,細胞增殖受到明顯抑制,TopoⅡα mRNA及其蛋白的表達逐漸減低與細胞的增殖受到抑制有關(guān)。TopoⅡα的表達水平與細胞的分化程度呈反比。
3 SH-SY-5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,Sp1,TopoⅡβ的mRNA及其蛋白的表達逐漸增加與神經(jīng)干細胞的分化密切相關(guān),TopoⅡβ的表達水平與細胞的分化程度呈正比,即表達高者神經(jīng)元分化程度高。
4轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過特異性的結(jié)合TopoⅡβ基因啟動子的GC盒,上調(diào)T
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