DAPT阻斷Notch信號(hào)通路在TOCP誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、目的：
　　探討Notch在三鄰甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性中的關(guān)系，進(jìn)一步闡述TOCP神經(jīng)毒性的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.以不同濃度TOCP（0、0.25、0.50、1.0mM）處理SH-SY5Y細(xì)胞，同時(shí)設(shè)計(jì)平行實(shí)驗(yàn)，先用 DAPT預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min，再用TOCP(0、0.25、0.50、1.0mM)染毒處理48h

2、，用MTT方法檢測兩種處理對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響；Western Blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平。
　　2. DAPT預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min，再染毒0.50mM TOCP24h，收集細(xì)胞（以0.1％DMSO為對(duì)照組），Western Blot檢測自噬蛋白 Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平；用自噬泡特異性染色劑MDC進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察各組自噬泡的變化。
　　3.采用全反式維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化

3、，DAPT預(yù)處理未分化和已分化的SH-SY5Y細(xì)胞30min后，用0.50mM TOCP染毒24h，以DMSO為對(duì)照組，Western Blot檢測NF-H，tau，p-tau蛋白表達(dá)量。
　　4.采用 DAPT預(yù)處理 SH-SY5Y細(xì)胞和 sh-Beclin1細(xì)胞30min，再用0.50mM TOCP染毒24h，Western Blot檢測兩組細(xì)胞系凋亡相關(guān)基因Bcl-2， BAX，Casepase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果

4、：
　　1.與對(duì)照組相比，隨著TOCP濃度增加，TOCP染毒組和DAPT預(yù)處理后染毒TOCP組，細(xì)胞存活率都隨之下降，但采用DAPT預(yù)處理阻斷Notch，再進(jìn)行0.25mM，0.5mM TOCP染毒組的細(xì)胞存活率比單獨(dú) TOCP染毒組高（P<0.05），而當(dāng)TOCP染毒濃度為1.0mM時(shí)，與相應(yīng)DAPT預(yù)處理組比較，存活率無顯著性差異（P<0.05）。
　　2. TOCP染毒組和 DAPT預(yù)處理后染毒 TOCP組抑制 SH-

5、SY5Y細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白NIC1和Hes1蛋白表達(dá)（P<0.05），而DAPT預(yù)處理組的NIC1和Hes1蛋白表達(dá)更低（P<0.05）。
　　3. DAPT預(yù)處理SH-SY5Y后TOCP染毒組以及0.50 mM TOCP染毒組與對(duì)照組比較，DAPT預(yù)處理組Beclin1和LC3表達(dá)受抑制（P<0.05）。MDC染色結(jié)果顯示，DAPT預(yù)處理+0.50 mM TOCP染毒組產(chǎn)生的自噬泡數(shù)量比單獨(dú)TOCP染毒組減少。

6、>　　4.與對(duì)照組比較，DAPT預(yù)處理未分化和已分化SH-SY5Y細(xì)胞后再進(jìn)行TOCP染毒，比單獨(dú)0.50mM TOCP染毒，NF-H蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，但DAPT預(yù)處理組tau蛋白水平下降（P<0.05），而p-tau在0.50mM TOCP染毒組表達(dá)量最低（P<0.05）。
　　5. DAPT預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞和sh-Beclin1細(xì)胞和0.50mM TOCP染毒，以DMSO為對(duì)照組，Western blo

7、t檢測相關(guān)凋亡蛋白，SH-SY5Y細(xì)胞中bcl-2/bax以及 Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)無顯著性差異（ P<0.05）。在sh-Beclin1細(xì)胞中，DAPT預(yù)處理+0.50 mM TOCP染毒組的bcl-2/bax比值比單獨(dú)0.50mM TOCP染毒高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TOCP可抑制Notch信號(hào)通路NIC1和Hes1蛋白表達(dá)。
　　2. DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，可