川芎嗪體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞.pdf

1、目的:從新生兒臍帶分離并培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定;觀察不同濃度川芎嗪在體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的作用，初步探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　方法:取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，以D-Hank's充分沖洗，將剩余的臍帶間質(zhì)組織切割成1mm3大小的組織塊，0.2％膠原酶Ⅱ消化，在含有20％胎牛血清(FBS)、2 ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、25 mM

2、左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80％～90％融合時(shí)，加入0.25％胰酶-1mM EDTA消化細(xì)胞，并傳代。
　　收集消化后的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)行細(xì)胞表型檢測(cè)，包括CD73、CD90和CD105、CD19、CD34、CD45、CD11和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)

3、照。
　　原代hUMSCs按1∶1的比例傳代后是為P1代，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化，細(xì)胞達(dá)到90％以上融合時(shí)按1∶2或1∶3比例進(jìn)行傳代，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　擴(kuò)增后取第5代細(xì)胞，接種于四個(gè)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加入全培養(yǎng)基2.5mL，培養(yǎng)方法同細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將四個(gè)六孔板隨機(jī)分為A、B、C、D四組，待各組培養(yǎng)的細(xì)胞融合至70％時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌2次，前三組設(shè)為含不同濃度川芎嗪誘導(dǎo)液的實(shí)驗(yàn)組，濃度依次為:A

4、組4.67mg/mL、B組2.34 mg/mL、C組1.17 mg/mL，誘導(dǎo)液用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基配制，D組設(shè)為對(duì)照組，只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察四組誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化情況，每0.5h倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化，連續(xù)觀察6小時(shí)，第6小時(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞表面標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)情況，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果以(

5、X)±s表示。
　　結(jié)果:原代細(xì)胞接種12h后多數(shù)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞最初呈菱形、橢圓形生長(zhǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楦鼮榫坏拈L(zhǎng)梭形，當(dāng)細(xì)胞融合至90％時(shí)，低倍鏡下細(xì)胞排列為放射狀、旋渦狀生長(zhǎng)。連續(xù)傳代后仍保持旺盛的增殖能力。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3、P5和P10代細(xì)胞表面分子標(biāo)記，結(jié)果顯示各代均表達(dá)CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。
　　

6、A組加入誘導(dǎo)液后0.5h可見(jiàn)約40％細(xì)胞收縮成橢圓形或球形，并伸出多條細(xì)長(zhǎng)的突起，1h時(shí)神經(jīng)樣細(xì)胞的比例可達(dá)55％左右，細(xì)胞進(jìn)一步收縮，突起伸長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞突起相互連接成網(wǎng)狀，1.5h可見(jiàn)85％左右的神經(jīng)樣細(xì)胞，4h可見(jiàn)部分神經(jīng)樣細(xì)胞開(kāi)始脫落6h神經(jīng)樣細(xì)胞比例約80％。B組加入誘導(dǎo)液后1.5h細(xì)胞發(fā)生明顯變化，可見(jiàn)45％左右的神經(jīng)樣細(xì)胞，至第2h達(dá)80％，之后可見(jiàn)零星神經(jīng)樣細(xì)胞脫落，至第6h該比例降至70％左右。C組細(xì)胞于誘導(dǎo)后4.5h可

7、見(jiàn)30％左右的神經(jīng)樣細(xì)胞，但伴隨著細(xì)胞的脫落，至第6h該比例為55％左右。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)誘導(dǎo)前后未見(jiàn)明顯變化。誘導(dǎo)至第6小時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組各組神經(jīng)樣細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)表達(dá)陽(yáng)性，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)陰性，A組（4.67mg/mL組）細(xì)胞NSE、NF-H陽(yáng)性表達(dá)率最高。對(duì)照組誘導(dǎo)前后無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:hUCMSCs可以在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代，并保持較高的增殖能力;傳