紫外線誘導(dǎo)家蠶卵巢細(xì)胞（BmN—SWU1）凋亡的研究.pdf

1、目前華中師大實(shí)驗(yàn)小組已經(jīng)證明，在紫外線照射或桿狀病毒誘導(dǎo)的昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡中，cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,提示了與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡相同，這表明線粒體在昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡中也具有重要作用。作為生物學(xué)、遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)模式昆蟲(chóng)之一的家蠶，其細(xì)胞凋亡研究尚處于初始階段,是否存在線粒體途徑仍然未知。本研究以家蠶卵巢細(xì)胞BmN-SWU1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了初步的研究，獲得了以下研究結(jié)果。 1 Bmcytc基因克隆與信

2、息分析本實(shí)驗(yàn)成功克隆了家蠶Bmcytc基因，cDNA長(zhǎng)為570bp，ORF長(zhǎng)324bp(ORF：84-407)，編碼108個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為11.7 kD。通過(guò)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，編碼蛋白含有一個(gè)典型的cytc結(jié)構(gòu)域。通過(guò)多序列比對(duì)顯示，與NCBI登錄的人、大鼠和果蠅(cytc-d和cytc-p)的蛋白序列相似性分別為75％，83％，75％和88％。基岡組序列分析結(jié)果顯示Bmcytc基因具有4個(gè)外顯子，外顯子/內(nèi)含子邊界處均符合GT-A

3、G規(guī)則。參與凋亡時(shí)與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)在家蠶細(xì)胞色素C中是基本保守的。 2 UVC誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡UVC處理家蠶BmN-SWU1細(xì)胞后，可誘導(dǎo)BmN-SWU1細(xì)胞產(chǎn)生典型細(xì)胞凋亡。光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜表面突出或形成小泡，細(xì)胞破裂成凋亡小體。UVC處理24h后，細(xì)胞幾乎全部破裂成凋亡小體。Hoechest33258染色顯示感染細(xì)胞核逐漸形交，直至破裂成小塊而被凋亡小體包裹。BmN-SW

4、U1細(xì)胞處理后DNA瓊脂糖凝膠電泳成典型凋亡細(xì)胞DNA梯形電泳譜帶。 3 UVC誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)線粒體變化流式細(xì)胞儀對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,細(xì)胞經(jīng)羅丹明(Rho-123)染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，UVC處理后12h的BmN-SWU1細(xì)胞中，膜電位下降的細(xì)胞明顯增多，熒光峰左移，即朝熒光強(qiáng)度減少的方向移動(dòng)，說(shuō)明此時(shí)膜電位下降。Western Blotting檢測(cè)蛋白cytc在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的含量