IL-1β對外周神經系統華勒變性中施旺細胞的影響.pdf

1、研究目的:
　　通過改進后的大鼠坐骨神經體外華勒氏變性模型，進一步確認該模型的可靠性，并以該模型為基礎，研究外周神經系統華勒變性早期施旺細胞IL-1β的表達情況，以及IL-1β對施旺細胞去分化、增殖及凋亡影響，并研究探討相關的作用機制，希望以此為窗口來探尋局部組織損傷后炎癥因子對成體細胞去分化及組織再生的影響。
　　研究方法:
　　1.體外華勒氏變性模型的制備及分組干預.
　　2.Real time PCR測定體

2、外華勒氏變性模型中不同時間點(6H、12H、24 H)施旺細胞IL-1β mRNA表達量。
　　3.Elisa測定體外華勒氏變性模型中不同時間點(12H、24 H、36H、48H)施旺細胞IL-1β蛋白的表達量。
　　4.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預（0 ng/ml、5 ng/ml和50 ng/ml）48小時后，免疫熒光染色標記施旺細胞去分化指標p75NTR和分化指標MPZ，并且Western Blot分別檢測并

3、量化比較p75NTR和MPZ蛋白表達量。
　　5.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對照組）或5 ng/ml IL-1β干預后，Realtime PCR檢測不同時間點(6H、12H、24 H)去分化指標p75NTR和分化指標MPZ mRNA表達量。
　　6.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預（0 ng/ml和5 ng/ml）24小時，免疫熒光染色標記施旺細胞轉錄因子c-Jun，并統計比較c-Jun陽性率;Wester

4、nBlot檢測進一步量化比較轉錄因子c-Jun表達量差異。
　　7.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對照組）或5 ng/ml IL-1β干預后，Realtime PCR檢測不同時間點(6H、12H、24 H)轉錄因子c-Jun mRNA表達量。
　　8.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml（對照組）或5 ng/ml IL-1β干預后，AP-1activity assay檢測不同時間點(6H、12H、24 H)核轉錄激活蛋白

5、1(AP-1)的活性相對值。
　　9.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預（0 ng/ml和5 ng/ml）48小時，免疫熒光染色標記施旺細胞增殖標記Ki67，并統計比較Ki67陽性率（即細胞增殖率）。
　　10.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預（0 ng/ml和5 ng/ml）48小時，Tunel法染色標記施旺細胞細胞凋亡情況，并統計各組Tunel陽性率（即細胞凋亡率）。
　　11.體外華勒氏變性模型不同

6、濃度IL-1β干預（0 ng/ml和5 ng/ml）24小時，Western Blot檢測細胞凋亡促進蛋白Bax和細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達量，統計比較Bcl-2和Bax表達量以及Bcl-2/Bax比值。
　　12.數據處理及統計學分析方法.
　　研究結果：
　　1.體外華勒氏變性模型中施旺細胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表達量變化
　　大鼠坐骨神經受損離體后華勒氏變性過程中施旺細胞IL-1βmRN

7、A和IL-1β蛋白表達量逐漸增高，IL-1βmRNA于12小時較對照組升高了近7倍達到高峰期，隨后開始有所降低;IL-1β蛋白分泌量逐漸增高，于36小時較對照組升高了近4倍達到高峰期，隨后開始有所降低。
　　2.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ表達情況
　　LSD法檢驗不同濃度組與對照組0 ng/ml之間的表達差異），5 ng/ml濃度組較對照組0 ng/ml中p75NTR表達量顯著升高(p=0.00

8、8)，MPZ表達量顯著降低(p=0.005);50ng/ml濃度組較對照組0 ng/ml中p75NTR以及MPZ表達量差別無統計學意義。Western Blot檢測與免疫熒光染色結果一致。
　　3.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ mRNA表達情況
　　Real time PCR檢測結果顯示，IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中施旺細胞p75NTR mRNA表達量顯著升高，而MPZ mRNA表達量顯著

9、降低。
　　4.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中轉錄因子c-Jun表達情況
　　適當濃度（5 ng/ml）IL-1β可促進坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞細胞核內轉錄因子c-Jun表達。
　　5.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中c-Jun mRNA表達情況
　　適當濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞細胞核內轉錄因子c-Jun表達。
　　6.IL-1β干預后體外華

10、勒氏變性模型中AP-1的活性變化情況
　　適當濃度(5 ng/ml) IL-1β不僅促進坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞細胞核內轉錄因子c-Jun表達，而且增加華勒氏變性過程中施旺細胞AP-1的活性。
　　7.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中細胞增殖標記Ki67表達情況
　　給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時，免疫熒光染色標記施旺細胞增殖標記Ki67，觀察可見Ki

11、67均主要位于細胞核內，且5 ng/ml干預組Ki67表達量較0 ng/ml組有所升高;量化比較兩組之間施旺細胞的細胞核內Ki67陽性率，5 ng/ml干預組Ki67陽性率較0 ng/ml組顯著升高(t=-6.264，p=0.003)。免疫熒光染色顯示，適當濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞的增殖。
　　8.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中細胞凋亡情況
　　給于體外華勒氏變性模型不同

12、濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時，Tunel法染色標記施旺細胞細胞凋亡情況，并統計各組Tunel陽性率（即細胞凋亡率）的差異，顯示5 ng/ml干預組凋亡率較0 ng/ml組顯著降低(t=4.274，p=0.013)。Tunel法細胞凋亡檢測顯示，適當濃度(5 ng/ml) IL-1β可抑制坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞的凋亡。
　　9.IL-1β干預后體外華勒氏變性模型中Bax和Bcl-2表達情況<

13、br>　　給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)24小時，Western Blot檢測細胞凋亡促進蛋白Bax和細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達量，顯示5 ng/ml濃度組較對照組0 ng/ml中施旺細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表達量顯著升高（t=-3.456，p=0.026），凋亡促進蛋白Bax表達量顯著降低(t=3.052，p=0.038)，且Bcl-2/Bax蛋白表達量比例顯著升高(t=-4.

14、397，p=0.012)。這與Tunel法凋亡細胞染色結果一致?？梢?，適當濃度(5 ng/ml) IL-1β可增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達量，降低凋亡促進蛋白Bax表達量，從而抑制坐骨神經華勒氏變性過程中施旺細胞凋亡。
　　研究結論：
　　本實驗研究顯示，體外華勒氏變性模型是研究周圍神經系統華勒氏變性過程中干預施旺細胞去分化影響因素的有效模型。通過該模型，我們研究進一步證實華勒氏變性早期施旺細胞IL-1β mRNA表達量升

15、高，IL-1β蛋白分泌量增多，華勒氏變性可視為外周神經系統應對神經損傷的固有免疫反應。通過該模型給予相應干預，我們研究發(fā)現適當濃度的IL-1β具有促進華勒氏變性過程中施旺細胞去分化的作用，以及促進華勒氏變性過程中施旺細胞清除髓鞘碎片，從而促進周圍神經再生，而過高濃度的IL-1β對華勒氏變性過程中施旺細胞去分化以及髓鞘碎片的清除并無促進作用。
　　本研究證實華勒氏變性早期適當濃度的IL-1β具有促進施旺細胞轉錄因子c-Jun mRN

16、A表達量，以及促進施旺細胞的細胞核內轉錄因子c-Jun的高表達，并促進施旺細胞內AP-1活化;并認為華勒氏變性早期IL-1β通過c-Jun/AP-1通路促進施旺細胞去分化，以及促進施旺細胞清除髓鞘碎片，從而促進周圍神經再生。
　　本研究證實華勒氏變性早期適當濃度的IL-1β具有促進施旺細胞增殖，以及增加Bcl-2表達量，減低Bax表達量，升高Bcl-2/Bax比值，抑制施旺細胞凋亡的積極作用;并認為IL-1β通過促進c-Jun/A