瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纖維素酶誘導(dǎo)表達過程中作用機制的研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素來源的生物燃料是一種清潔的可再生能源，能部分替代目前人們對化石能源的需求，然而就目前的技術(shù)水平而言，將植物生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的單糖是生物燃料生產(chǎn)的主要瓶頸。自然界中存在大量能夠降解植物生物質(zhì)的微生物，是我們轉(zhuǎn)化和利用木質(zhì)纖維素的基礎(chǔ)。其中絲狀真菌瑞氏木霉（Trichodermareesei）是纖維素降解微生物的典型代表，它的一個重要生理特性是在不溶性的纖維素、半纖維素以及一些植物生物質(zhì)組分存在條件下，能夠大量分泌纖維素酶，

2、從而有效水解植物生物質(zhì)。因為這些不溶性的底物無法進入細胞，由它們釋放的可溶性寡糖包括纖維二糖以及槐糖等被認為是真正的誘導(dǎo)物，但目前這種假設(shè)還缺少足夠的實驗證據(jù)。
　　除了纖維二糖和槐糖，非植物細胞壁組分的乳糖也可以誘導(dǎo)瑞氏木霉產(chǎn)生纖維素酶，但目前人們對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達的機制也不甚了解。雖然有實驗證據(jù)表明乳糖的胞外水解以及隨后的半乳糖代謝與纖維素酶誘導(dǎo)表達有一定相關(guān)性，但是也有證據(jù)表明瑞氏木霉對乳糖的吸收和胞內(nèi)代謝在纖維素酶的誘

3、導(dǎo)表達過程中起到重要作用。到目前為止在瑞氏木霉中負責(zé)胞內(nèi)水解和轉(zhuǎn)化乳糖的蛋白尚未得到鑒定。
　　有證據(jù)顯示瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在誘導(dǎo)物合成以及菌體快速響應(yīng)纖維素的過程中發(fā)揮重要作用，例如胞外主要β-葡萄糖苷酶bgl1/cel3a基因的缺失導(dǎo)致纖維素酶基因誘導(dǎo)表達延遲，而過表達bgl1/cel3a基因的菌株在纖維素和槐糖誘導(dǎo)條件下纖維素酶基因的表達水平提高?；蚪M信息分析表明，瑞氏木霉一共含有11個β-葡萄糖苷酶編碼基因，其中Bg

4、l1/Cel3a是胞外主要的β-葡萄糖苷酶，屬于糖苷水解酶第3家族，而Cel1a和Cel1b是胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶，屬于糖苷水解酶第1家族。轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，這三個β-葡萄糖苷酶在纖維素和乳糖誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)錄上調(diào)最為顯著，是瑞氏木霉最主要的β-葡萄糖苷酶，它們在瑞氏木霉纖維素酶基因誘導(dǎo)表達過程中的作用有待于進一步的研究。大多數(shù)糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶同時具有β-半乳糖苷酶活性，是乳糖胞內(nèi)代謝酶的重要候選蛋白，瑞氏木霉第1家族的β-

5、葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否具有乳糖水解活性以及它們在乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達過程中是否發(fā)揮作用目前還不清楚。
　　為了深入闡釋瑞氏木霉三個主要的β-葡萄糖苷酶Bgl1/Cel3a、Cel1a和Cel1b在纖維素酶基因誘導(dǎo)表達過程中的作用，我們將這三個β-葡萄糖苷酶的編碼基因分別進行了敲除以及組合多敲除。詳細研究了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株響應(yīng)纖維素、纖維二糖、槐糖以及乳糖等碳源表達纖維素酶的能力，對瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶影響

6、纖維素酶誘導(dǎo)表達的機制進行了分析。同時研究了瑞氏木霉兩個糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b對乳糖的水解和轉(zhuǎn)化作用，并分析了Cel1a和Cel1b對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達的影響及其發(fā)揮作用的機制。本論文的主要創(chuàng)新結(jié)果如下:
　　1.對瑞氏木霉三個主要β-葡萄糖苷酶編碼基因bgl1/cel3a，cel1a以及cel1b進行基于同源重組原理的基因敲除，同時構(gòu)建了多基因缺失菌株△cel1a△cel1b和△triβG，以

7、研究不同β-葡萄糖苷酶的生物學(xué)功能。
　　為了研究不同β-葡萄糖苷酶的功能，我們通過同源雙交換的手段構(gòu)建了一系列β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株△cel1a，△cel1b，△cella△cellb和△triβG(bgl1，cel1a和cel1b同時缺失)，錨定PCR以及Southernblot驗證了基因敲除以及單拷貝整合。我們進一步分析了不同β-葡萄糖苷酶的缺失對瑞氏木霉胞內(nèi)外β-葡萄糖苷酶總酶活的影響。在纖維素培養(yǎng)條件下，與野生型菌株

8、相比△cel1b菌株胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶酶活只有輕微下降，而△cel1a菌株胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶酶活下降75％，△cel1a△cel1b菌株胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶酶活與△cel1a菌株類似，說明Cel1a是胞內(nèi)主要的β-葡萄糖苷酶，Cel1b對胞內(nèi)總β-葡萄糖苷酶酶活的貢獻不大。Bgl1/Cel3a缺失后瑞氏木霉胞外β-葡萄糖苷酶活性僅有10％殘留，說明Bgl1/Cel3a是瑞氏木霉胞外最主要的β-葡萄糖苷酶。
　　2.比較了不同β-葡萄

9、糖苷酶基因缺失菌株在纖維素以及槐糖上的生長和纖維素酶誘導(dǎo)表型，證明在不溶性纖維素誘導(dǎo)條件下纖維素酶基因的快速誘導(dǎo)表達需要β-葡萄糖苷酶的參與。
　　我們首先研究了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶是否參與不溶性纖維素誘導(dǎo)纖維素酶表達的過程。通過測定不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株在纖維素培養(yǎng)過程中的生長曲線，我們發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的缺失影響菌株對纖維素的利用。此外，在纖維素誘導(dǎo)條件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株發(fā)酵液中總蛋白量和纖維素酶酶活均比野

10、生型菌株低。我們進一步使用Northernblot和qRT-PCR的方法研究了纖維素誘導(dǎo)條件下不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株纖維素酶基因cbh1的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)。結(jié)果顯示瑞氏木霉野生型菌株在纖維素誘導(dǎo)3h之后cbh1轉(zhuǎn)錄即可達到較高水平，而△cel1b菌株需要誘導(dǎo)6h，△cel1a菌株需要誘導(dǎo)24h，△cel1a△cel1b菌株需要誘導(dǎo)36h，△triβG菌株則需要誘導(dǎo)48h才能達到與野生型類似的水平。β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株發(fā)酵液中CB

11、HI的表達也呈現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄類似的結(jié)果。與纖維素不同，槐糖誘導(dǎo)條件下△cel1a△cel1b菌株cbh1轉(zhuǎn)錄動力學(xué)與野生型一致，說明β-葡萄糖苷酶在槐糖誘導(dǎo)纖維素酶表達過程中并未發(fā)揮重要作用。綜上所述，我們證明了這三個β-葡萄糖苷酶在瑞氏木霉菌株快速響應(yīng)纖維素啟動纖維素酶表達過程中發(fā)揮了重要作用，它們有可能參與了誘導(dǎo)物的合成。
　　3.通過分析在纖維二糖誘導(dǎo)條件下瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株的纖維素酶表達表型，證明主要β-葡萄

12、糖苷酶的缺失能提高纖維二糖對纖維素酶的誘導(dǎo)能力，瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶對纖維二糖的轉(zhuǎn)化作用在纖維素酶誘導(dǎo)表達過程中并未發(fā)揮重要作用。
　　作為纖維素的主要降解產(chǎn)物，纖維二糖在低濃度下也可以誘導(dǎo)瑞氏木霉產(chǎn)生纖維素酶，而且有證據(jù)顯示瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶能夠在體外將纖維二糖通過轉(zhuǎn)糖基作用轉(zhuǎn)化為槐糖這一強效誘導(dǎo)物。為了分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶表達過程中發(fā)揮的作用，首先我們摸索了在瑞氏木霉中纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶

13、表達的最佳濃度。實驗確定0.25％(w/v)纖維二糖為最佳誘導(dǎo)濃度。其次我們通過Westernblot測定了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株發(fā)酵液中CβHI表達量，并使用qRT-PCR檢測了菌體纖維素酶cbh1基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示在纖維二糖誘導(dǎo)條件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中纖維素酶的表達水平明顯高于野生型，說明降低瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶的活性能提高纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶表達的能力，瑞氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶對纖維二糖的轉(zhuǎn)化作用在纖維素

14、酶的誘導(dǎo)表達過程中并未發(fā)揮重要作用。最后，我們在纖維素培養(yǎng)過程中外源添加一定比例的纖維二糖，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株快速響應(yīng)纖維素產(chǎn)生纖維素酶的能力得到恢復(fù)，表明β-葡萄糖苷酶可能通過調(diào)控胞外纖維二糖的水平影響纖維素誘導(dǎo)條件下纖維素酶基因的快速表達。
　　4.證明瑞氏木霉胞內(nèi)主要β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b在乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達過程中發(fā)揮重要作用。Cel1a和Cel1b的缺失影響纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyr1的表達

15、，但是組成型回補表達Xyr1并不能恢復(fù)β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株響應(yīng)乳糖產(chǎn)生纖維素酶的能力。
　　瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶是乳糖胞內(nèi)代謝酶的重要候選蛋白，因此我們分析了β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否影響菌體對乳糖的利用以及乳糖誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達。通過生長曲線的測定，我們發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的缺失影響菌體在乳糖碳源上的生長，但是并不影響菌體對半乳糖的利用。通過Westernblot分析乳糖培養(yǎng)條件下

16、β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株發(fā)酵液中纖維素酶CBHI的表達，我們發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶基因cel1a的缺失導(dǎo)致乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達延遲，而在雙缺菌株△cel1a△cel1b中纖維素酶的表達完全缺失。進一步通過qRT-PCR分析纖維素酶基因cbh1的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶基因缺失菌中纖維素酶表達的滯后或缺失發(fā)生在轉(zhuǎn)錄層面，說明瑞氏木霉胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達是必需的。Xyr1是調(diào)控纖維素酶基因誘導(dǎo)表達的關(guān)鍵

17、轉(zhuǎn)錄因子，因此我們分析了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中xyr1基因的轉(zhuǎn)錄水平，實驗發(fā)現(xiàn)雖然β-葡萄糖苷酶的缺失造成xyr1基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，但在△cel1a△cel1b菌株中組成型表達xyr1并不能恢復(fù)菌株響應(yīng)乳糖產(chǎn)生纖維素酶的能力。上述結(jié)果表明胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶在乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達過程中發(fā)揮了重要作用，β-葡萄糖苷酶不僅影響了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Xyr1的表達，還通過其他途徑影響乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達的過程，β-葡萄糖苷酶發(fā)揮作用的機制還需要

18、進一步的分析。
　　5.通過分析Cel1a和Cel1b重組蛋白的底物特異性，證明瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶具有乳糖水解活性和轉(zhuǎn)化活性。
　　糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶往往具有β-半乳糖苷酶活性，瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b可能在乳糖胞內(nèi)代謝過程中發(fā)揮作用。因此我們通過大腸桿菌異源表達和純化了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b，并對其底物特異性進行了分析。我

19、們發(fā)現(xiàn)Cel1a和Cel1b不僅能夠水解纖維二糖及其類似物pNPG，還能夠水解乳糖類似物ONPG，證明其具有β-半乳糖苷酶活性。通過HPLC分析β-葡萄糖苷酶Cel1a與乳糖反應(yīng)的產(chǎn)物，我們發(fā)現(xiàn)除了D-葡萄糖和D-半乳糖，還有其他半乳寡糖產(chǎn)生，表明β-葡萄糖苷酶Cel1a可能具有乳糖轉(zhuǎn)糖基活性。瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶具有的這種糖苷水解活性在纖維素酶誘導(dǎo)表達過程中的作用還需要進一步的研究。
　　6.證明了瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶具

20、有的糖苷水解活性對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達是必需的。
　　為了進一步分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b所具有糖苷水解活性對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達的影響，我們在瑞氏木霉△cel1a菌株中組成型表達了野生型Cel1a蛋白以及水解活性缺失點突變體Cel1a(Q367A)蛋白。在乳糖誘導(dǎo)條件下，組成型回補野生型Cel1a蛋白使得△cel1a菌株cbh1的轉(zhuǎn)錄得到恢復(fù)，cbh1轉(zhuǎn)錄起始時間甚至比野生型提前，cbh1轉(zhuǎn)錄量也有所升高，

21、而回補水解活性缺失點突變體Cel1a(Q367A)蛋白的菌株cbh1轉(zhuǎn)錄并未恢復(fù)，轉(zhuǎn)錄起始時間與野生型相比仍然有明顯的滯后，這些結(jié)果說明Cel1a的糖苷水解活性對乳糖誘導(dǎo)纖維素酶的表達是必需的。為了進一步分析β-葡萄糖苷酶具有的乳糖水解活性在纖維素酶誘導(dǎo)表達過程中的作用，我們在△cel1a菌株中組成型表達了乳酸克魯維酵母來源的胞內(nèi)β-半乳糖苷酶Lac4，結(jié)果顯示回補Lac4并不能恢復(fù)△cel1a菌株纖維素酶基因cbh1的轉(zhuǎn)錄，表明僅有乳