脂筏特征蛋白flotillin-2的調控及功能研究.pdf

1、近10年來的研究表明,在生物膜上存在著富含鞘脂和膽固醇的微區(qū)結構(microdomain)——脂筏(Lipidrafts),該區(qū)域內存在著大量和信號轉導相關的蛋白,包括GPI錨聯(lián)蛋白、G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體和激酶等。除此之外,脂筏主要包含特有的、標志性的結構蛋白,包括flotillin(reggie),caveolin和stomatin等,它們與上述信號分子相互作用形成蛋白質復合體,進一步調控信號轉導途徑。
　　Flotillin

2、蛋白家族由兩個同源性較高的蛋白flotillin-1和flotillin-2所構成,flotillin和紅細胞膜上的stomatin(Band7.2b)、線粒體的prohibition及細菌的HflK/HflC之間的同源性也相當高,其中同源性最強的序列稱為SPFH結構域,位于flotillin的N端,該結構域的可能功能是促進蛋白質與細胞膜之間的結合。此外,在flotillin的C端還存在另一結構域,flotillin結構域,被認為參與形

3、成卷曲螺旋結構,通過這一結構,flotillins之間可以形成同源和異源寡聚體。
　　因此,如果能了解flotillin-2這一脂筏特征結構蛋白的結構、功能及其調控機理,不僅對于闡明脂筏這一特殊的膜微區(qū)結構里蛋白質-蛋白質/蛋白質-脂質之間的相互作用具有重要意義,而且對于理解整個信號轉導途徑并進一步指導臨床實踐均有重要意義。為了篩選出能與flotillin-2相互作用的蛋白,通過酵母雙雜交的手段,我們篩選到flotillin-2可

4、與ASB-7(Ankyrinrepeatandsuppressorofcytokinesignaling(SOCS)boxprotein7)特異作用。ASB-7屬于ASB蛋白家族,該家族是SOCSbox超家族的主要成員?，F有研究結果說明,ASB家族蛋白質氨基端的ankyrinrepeat結構域主要和底物結合,而羧基端的SOCSbox結構域是構成泛素連接酶E3的元件之一,當ASB家族蛋白與Cul-5平臺蛋白,RING家族蛋白。Rbx-2以

5、及其他接頭蛋白(如Skpl和:ElonginB/C復合體等)形成E3復合體后,可促進E2和其結合的底物蛋白之間的相互作用,進而通過泛素化途徑使得底物降解。
　　通過一系列的體內細胞共定位以及體外pulldown實驗的結果,我們確認了兩者的相互作用,并且把相互作用位點定位在了flotillin-2N端的SPFH結構域和ASB-7N端的ankyrinrepeat結構域。然后通過過表達與干擾改變了ASB-7表達水平,然后檢測flotil

6、lin-2體內表達的變化,從而確認了ASB-7確實是通過SOCS結構域參與的途徑對flotillin-2進行負調控。
　　接下來我們希望大規(guī)模的生產出大量重組的人flotillin-2蛋白用于蛋白質結晶學研究從而解析其結構,因為flotillin-2等脂筏蛋白難溶于TritonX-100等常規(guī)去垢劑,使得脂筏蛋白質的結構研究很難進行。于是我們通過基因克隆的方法,在大腸桿菌中大量表達重組的flotillin-2,我們成功地表達了5種

7、融合了不同接頭的重組flotillin-2:His-Flot2,TRX-Flot2,GST-Flot2,NusA-Flot2和MBP-Flot2。經過優(yōu)化克隆和表達條件,選取了最佳的MBP-Flot2進行大規(guī)模表達,并通過離子交換層析和親和層析,每表達一升細菌培養(yǎng)液可以得到了36.0mg,純度超過97％的重組蛋白。并通過生化實驗驗證了重組蛋白的生化活性。
　　此外,對有可能參與flotillin-1/arginase-1相互作用體