ZHX2調(diào)控脂蛋白脂酶參與脂肪肝及細(xì)胞肝癌的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本課題擬深入研究ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制，并對其在改善腫瘤化療耐藥性中的作用進(jìn)行探討。
　　第一部分 ZHX2調(diào)控脂蛋白脂酶參與脂肪肝及肝細(xì)胞肝癌的作用及機(jī)制
　　一、ZHX2在多種肝癌細(xì)胞系中顯著抑制LPL表達(dá)
　　為明確ZHX2對LPL表達(dá)的調(diào)控作用，分別進(jìn)行ZHX2過表達(dá)及siRNA干擾實(shí)驗(yàn)。利用脂質(zhì)體在ZHX2本底表達(dá)低的細(xì)胞系HepG2、BEL7402、HEK293中轉(zhuǎn)染Z

2、HX2過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-ZHX2-HA，pcDNA3.0空載體為對照;在ZHX2本底表達(dá)高的細(xì)胞系SMMC7721、QSG7701細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染ZHX2siRNA, negtive control為對照。
　　二、ZHX2通過Octamer位點(diǎn)負(fù)性調(diào)控LPL啟動子活性
　　1.ZHX2顯著抑制LPL啟動子活性
　　首先構(gòu)建LPL全長啟動子報告質(zhì)粒pGL3-LPLp(-1678～+67)，分別與ZHX2過表達(dá)載體

3、共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和CHO細(xì)胞，與ZHX2 siRNA共轉(zhuǎn)染SMMC7721、QSG7701細(xì)胞。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，ZHX2過表達(dá)能明顯抑制LPL啟動子活性，而干擾ZHX2表達(dá)，LPL啟動子活性顯著升高。
　　2.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-96～-38nt是ZHX2抑制LPL啟動子的關(guān)鍵片段
　　3.ZHX2通過Octamer抑制LPL啟動子活性
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分布，重新構(gòu)建截短啟動子-52～+67，

4、共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示ZHX2仍舊對其活性有很好的抑制作用。TFSEARCH軟件分析顯示，LPL啟動子-52～-38之間的重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)只有一個，即Octamer。為驗(yàn)證其作用，設(shè)計突變引物，利用突變試劑盒將該區(qū)域的Octamer位點(diǎn)進(jìn)行突變，并構(gòu)建報告質(zhì)粒pGL3-LPLp-96-Octamer-mutant。
　　4.EMSA及ChIP實(shí)驗(yàn)顯示ZHX2能與LPL啟動子Octamer位點(diǎn)結(jié)合
　　5.Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示ZH

5、X2可以與轉(zhuǎn)錄因子Oct-1結(jié)合
　　ZHX2含有與蛋白相互作用的HD1功能域。為研究ZHX2能否跟與Octamer結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1結(jié)合，用pcDNA3.0-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，IP抗體ZHX2雜交的蛋白能夠與Oct-1結(jié)合，說明ZHX2能夠與轉(zhuǎn)錄因子Oct-1相互結(jié)合。
　　三、ZHX2通過抑制LPL減輕肝

6、癌細(xì)胞系及小鼠肝臟的脂肪變
　　LPL是機(jī)體水解脂蛋白的限速酶，并介導(dǎo)肝細(xì)胞攝取脂蛋白，在多種脂代謝相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。ZHX2對LPL的調(diào)控作用提示ZHX2參與脂代謝相關(guān)疾病，為驗(yàn)證該假說，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
　　1.ZHX2通過抑制LPL，減輕脂肪乳誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變
　　(1)脂肪乳誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變模型中ZHX2與LPL表達(dá)負(fù)相關(guān)
　　(2) ZHX2抑制脂肪乳誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪沉積，

7、LPL過表達(dá)逆轉(zhuǎn)上述過程
　　2.ZHX2通過負(fù)調(diào)控LPL表達(dá)抑制小鼠肝臟脂肪變
　　(1)脂肪肝小鼠模型肝組織中ZHX2表達(dá)顯著降低
　　為進(jìn)一步研究ZHX2及LPL在脂肪肝中的可能作用，分別利用膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient，MCD)飲食及高脂飲食(High-fat diet，HFD)誘導(dǎo)小鼠脂肪肝模型。抽提肝組織RNA，RT-PCR檢測Afr1（小鼠ZHX2）及LPL的

8、表達(dá)。結(jié)果顯示，不論是哪種方式誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變，其肝內(nèi)Afr1的表達(dá)均明顯低于正常飲食組，相應(yīng)的LPL的表達(dá)均高于正常飲食組。提示，ZHX2調(diào)控LPL參與肝臟脂肪變。
　　(2)干擾ZHX2促進(jìn)小鼠肝臟脂肪變
　　為驗(yàn)證ZHX2在體內(nèi)參與肝臟脂肪變的作用，構(gòu)建針對Afr1的小干擾慢病毒Lenti-Virus-Afr1-shRNA，以每只小鼠3x10^7 TU慢病毒，10％體重(ml)的量，尾靜脈高壓注射C57BL/6小鼠

9、，一周后MCD飼喂。每周稱體重，兩周后處死小鼠，稱肝重，肝臟大體拍照，肝勻漿液測TG。肝冰凍切片油紅O檢測脂質(zhì)沉積，并用IPP6.0分析脂質(zhì)沉積面積。肝石蠟切片做HE染色，觀察肝損傷。結(jié)果顯示，MCD成功誘導(dǎo)肝臟脂肪變，且干擾Aff1表達(dá)顯著加重MCD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變。
　　(3)過表達(dá)LPL逆轉(zhuǎn)ZHX2對MCD誘導(dǎo)小鼠脂肪肝的抑制作用
　　四、ZHX2通過下調(diào)LPL表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長
　　文獻(xiàn)報道乳腺癌、脂肪

10、肉瘤組織中LPL表達(dá)顯著增加，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長。為研究LPL在ZHX2抑制HCC生長中的作用，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
　　1.肝癌患者癌組織LPL表達(dá)明顯高于癌旁組織，且ZHX2與LPL表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)
　　收集22例肝細(xì)胞肝癌及其對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR, Q-PCR)檢測LPL表達(dá)量。結(jié)果顯示HCC組織的LPL表達(dá)量明顯高于癌旁(p＜0.0

11、5)。
　　2.LPL以脂質(zhì)依賴性方式顯著促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞系的生長
　　3.LPL明顯改善ZHX2對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用，該作用依賴于脂質(zhì)的存在
　　4.LPL能夠逆轉(zhuǎn)ZHX2對荷瘤小鼠體內(nèi)H22肝癌細(xì)胞生長的抑制作用
　　綜上，本研究通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床標(biāo)本檢測，首次闡明ZHX2對LPL轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制并首次報道LPL在HCC癌組織的異常高表達(dá)及其促HCC生長作用。研究表明ZHX2作為一種轉(zhuǎn)錄

12、抑制因子，除了已知的對癌基因和周期蛋白的抑制之外，還可通過對脂代謝重要酶LPL的轉(zhuǎn)錄抑制，從而抑制肝細(xì)胞脂肪沉積，延緩脂肪肝的發(fā)生，并通過抑制LPL介導(dǎo)的脂肪攝取及累積抑制HCC生長。
　　第二部分 ZHX2通過下調(diào)MDR1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性
　　一、ZHX2顯著增強(qiáng)不同腫瘤細(xì)胞的化療敏感性
　　1.ZHX2表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞化療敏感性相關(guān)
　　本實(shí)驗(yàn)首先用肝癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系同時驗(yàn)證化療藥物順鉑(CDD

13、P)對細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，ZHX2內(nèi)源性表達(dá)高的細(xì)胞系(SMMC7721，A549)，CDDP對細(xì)胞的抑制率高，提示ZHX2可能會影響腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。
　　2.ZHX2增強(qiáng)肝癌及肺癌細(xì)胞系對順鉑及阿霉素的敏感性
　　將不同的細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染ZHX2的過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA后，加入不同濃度的CDDP和阿霉素(ADM)，24h后，CCK-8檢測細(xì)胞存活率，并計算半數(shù)抑制濃度IC50值。
　　3.ZHX2促進(jìn)CDDP介

14、導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，選取耐藥性較高的細(xì)胞系HepG2，過表達(dá)ZHX2后，用CDDP(20ug/ml，24h)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用AnnexinV-PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式檢測各組細(xì)胞凋亡情況。
　　二、ZHX2負(fù)向調(diào)控不同腫瘤細(xì)胞系中MDR1表達(dá)
　　MDR1是與腫瘤多藥耐藥性密切相關(guān)的基因，且其啟動子區(qū)NF-Y結(jié)合位點(diǎn)的存在提示我們此基因極有可能也被ZHX2所調(diào)控。
　　三、ZHX2顯著抑制

15、不同腫瘤細(xì)胞中的MDR1藥物泵功能
　　MDR1又被稱為P蛋白，可以以ATP依賴性方式將包括化療藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)選擇性泵出細(xì)胞外。為驗(yàn)證ZHX2對MDR1藥物泵的抑制作用，分別將pEGFP-N1-ZHX2轉(zhuǎn)染HepG2和SPC-A-1細(xì)胞，24h后，加入40ug/ml ADM。作用4h后，DAPI染核。
　　四、ZHX2通過影響NF-YA與MDR1啟動子相應(yīng)元件結(jié)合抑制MDR1轉(zhuǎn)錄
　　1.ZHX2劑量依賴性抑制MD

16、R1啟動子活性
　　ZHX2具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。為研究ZHX2對MDR1啟動子活性的抑制作用，分別將ZHX2過表達(dá)載體或ZHX2 siRNAs與MDR1啟動子報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細(xì)胞系。
　　2.ZHX2以NF-YA依賴性方式抑制MDR1轉(zhuǎn)錄活性
　　在MDR1野生型啟動子報告質(zhì)粒pGL3-Mp的基礎(chǔ)上，構(gòu)建ATTGG元件突變的MDR1啟動子載體pGL3-mMp，并將這兩種載體分別與ZHX2過表達(dá)載體或pcDNA

17、3.0共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測ZHX2對啟動子活性的影響。
　　3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤細(xì)胞中ZHX2能與NF-YA結(jié)合
　　為了確認(rèn)ZHX2與NF-YA的相互作用，將ZHX2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。48小時后裂解細(xì)胞，用NF-YA抗體及同型對照IgG作為IP抗體。免疫沉淀后的蛋白，用ZHX2抗體和NF-YA抗體進(jìn)行WB。
　　4.ZHX2干擾NF-YA與MDR1啟動子的結(jié)合
　　五、腫瘤組織標(biāo)本檢測