中性粒細(xì)胞極性化中TRPC1蛋白分子轉(zhuǎn)位及脂筏的激光共聚焦研究.pdf

1、研究背景：
　　 極性是真核細(xì)胞的基本生物學(xué)特征。細(xì)胞極性(cen polarity)對(duì)正常的細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞質(zhì)分裂以及組織、器官的形成等眾多生物學(xué)過(guò)程起著關(guān)鍵性的作用。細(xì)胞極性是指細(xì)胞為了行使特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化,在胞內(nèi)的信號(hào)分子不對(duì)稱分布致使細(xì)胞在表型上產(chǎn)生不對(duì)稱性。具體表現(xiàn)在細(xì)胞形狀、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)不對(duì)稱分布,細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)。極性細(xì)胞特征性變化是細(xì)胞內(nèi)必須的細(xì)胞骨架分子在細(xì)胞前極形成一個(gè)富含絲

2、狀肌動(dòng)蛋白的片狀偽足,而在后極形成尾足:細(xì)胞極化參與諸如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取、酵母繁殖、傷口修復(fù)、軸突生長(zhǎng)、血管發(fā)生、胚胎發(fā)育、原生動(dòng)物多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成和機(jī)體發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的遷移功能,所以目前將極性和生長(zhǎng)、發(fā)育等并列為細(xì)胞的基本功能。
　　 中性粒細(xì)胞生理學(xué)的發(fā)揮功能有賴于極性的形成。臨床上多種疾病如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷和器官移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及一些由于感染引起的器官衰竭反應(yīng)都與中性粒細(xì)胞極性功能的增強(qiáng)或減弱相

3、關(guān)。中性粒細(xì)胞是機(jī)體遭受外來(lái)細(xì)菌和其他病原體入侵時(shí)機(jī)體的第一道防線,而這種作用是建立在中性粒細(xì)胞極性和趨化性基礎(chǔ)上的。在各種趨化物的作用下,中性粒細(xì)胞憑借胞內(nèi)分子對(duì)極化信號(hào)的優(yōu)化和放大,能夠準(zhǔn)確確定炎癥部位并使其自身發(fā)生極性改變,最終向炎癥部位發(fā)生定向移動(dòng),而中性粒細(xì)胞極性化是其定向遷移的前提條件。
　　 多種分子參與趨化劑刺激導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程,近年來(lái)研究胞內(nèi)Ca2+濃度和分布的變化也涉及其中。中性粒細(xì)胞趨化劑甲酰甲硫

4、氨酰.亮氨酰.苯丙氨酸(fMLP)可以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫(kù)的釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫(kù)釋放可以激活SOCE通路,促進(jìn)細(xì)胞外鈣的內(nèi)流。在中性粒細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度的升高是其活化的必要條件,因而可通過(guò)SOC抑制劑來(lái)抑制中性粒細(xì)胞活性。TRPC可被胞內(nèi)鈣離子濃度激活,被認(rèn)為是最可能的鈣庫(kù)操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。但TRPC1作為SOC的主要候選分子是否參與中

5、性粒細(xì)胞極性化過(guò)程以及在此過(guò)程中起何種作用,阻斷TRPC1后對(duì)中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程以及趨化性有何影響,尚無(wú)確切報(bào)道。
　　 TRPC1在細(xì)胞極性化過(guò)程中可能起著重要的作用,而且這種作用可能與胞膜上存在的一類特殊脂質(zhì)結(jié)構(gòu)-脂筏(Lipid raft)存在密切的關(guān)系,其關(guān)鍵功能是它是一個(gè)信號(hào)的平臺(tái)。為了進(jìn)一步理解TRPC1和脂筏的關(guān)系,我們觀察了mDCD(甲基-β-環(huán)糊精,Methyl-β-cyclodextrin)對(duì)中性粒細(xì)胞極性

6、的影響。mβCD能夠清空中性粒細(xì)胞膽固醇,破壞脂筏完整性,從而可能影響到極性的形成過(guò)程。
　　 由于使中性粒細(xì)胞發(fā)生極性的各種機(jī)制之間的關(guān)系復(fù)雜又密切,尤其是SOCE機(jī)制的主要候選分子TRPC1在極化過(guò)程中的作用,以及其與脂筏的相互關(guān)系有待于進(jìn)一步研究與探討。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用均一、低濃度的fMLP作用于中性粒細(xì)胞建立細(xì)胞極性模型。通過(guò)觀察TRPCI通道蛋白分子的轉(zhuǎn)位；以及應(yīng)用TRPC通道抑制劑

7、(SK&F96365、2-APB)和破壞脂筏結(jié)構(gòu)的特異藥物(mβCD)預(yù)處理中性粒細(xì)胞進(jìn)而觀察對(duì)極性分子F-actin的影響以及對(duì)細(xì)胞極性的影響,從而探討TRPC1在中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中的作用以及和脂筏的關(guān)系。
　　 方法
　　 1.采用Dextran沉降法、標(biāo)準(zhǔn)的梯度密度離心和紅細(xì)胞裂解的方法分離人血中性粒細(xì)胞,進(jìn)行瑞氏.吉姆薩染色和臺(tái)盼藍(lán)染色分析細(xì)胞純度和細(xì)胞活力。
　　 2.應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)聚合F-a

8、ctin,TRPC1和脂筏在人中性粒細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)聚合F-actin,TRPC1和脂筏在dHL-60細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　 結(jié)果
　　 1.中性粒細(xì)胞分離后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞的活性大于98％,瑞氏-姬姆薩染色,細(xì)胞純度大于95％。
　　 2.在fMLP誘導(dǎo)的細(xì)胞極性過(guò)程中TRPC1蛋白分子、F-actin極性分子以及脂筏均發(fā)生極性分布；
　　 3.使用TRP