基于全基因組測序的副溶血弧菌種群進(jìn)化研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）屬于嗜鹽菌，廣泛存在于海水以及海產(chǎn)品中，在我國沿海地區(qū)，是引發(fā)食源性疾病的主要病原菌之一。副溶血弧菌的主要抗原為O抗原和K抗原，其抗原多樣性常用于菌株分型研究。從全基因組水平上對副溶血弧菌進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究，能夠使我們更清楚地了解該物種的進(jìn)化與傳播關(guān)系，進(jìn)一步推動(dòng)相關(guān)疾病的防控和溯源工作。另外，高頻同源重組是副溶血弧菌遺傳進(jìn)化的一個(gè)顯著特點(diǎn)，基于全基因組序列對該物種進(jìn)行種

2、群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化推動(dòng)力剖析，對認(rèn)清同源重組在細(xì)菌進(jìn)化過程中的作用具有重要意義。
　　本研究對采集自全球不同地區(qū)、不同分離時(shí)間的共157株副溶血弧菌進(jìn)行了全基因組測序，并對其基因組多態(tài)性進(jìn)行了深入分析，目的在于加深以下三個(gè)方面的認(rèn)識(shí):①副溶血弧菌整個(gè)種群的遺傳多樣性基本特征;②副溶血弧菌流行性克隆群的進(jìn)化以及全局種群結(jié)構(gòu);③估算種群有效種群大小(effective populationsize，Ne)并探索種群的進(jìn)化推動(dòng)力。
　　

3、副溶血弧菌的全基因組變異檢測
　　根據(jù)基因組序列在群體中的存在情況不同，可以將基因組序列劃分為核心基因組(core-genome)和泛基因組(pan-genome)。本研究中鑒定區(qū)分了157株副溶血弧菌的核心基因組和泛基因組，鑒定出核心基因組大小為4.07Mbp，泛基因組為17.33Mbp。
　　SNP指的是基因組水平上的單個(gè)核苷酸發(fā)生變異引起的DNA序列多態(tài)性。本研究基于全基因組的測序數(shù)據(jù)，使用包括MUMmer、SOAP在

4、內(nèi)的多種生物信息學(xué)軟件，檢測到存在于157株菌核心基因組上的共327，904個(gè)高質(zhì)量雙等位SNP。為后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)重建以及種群遺傳學(xué)參數(shù)的定量化計(jì)算提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　副溶血弧菌流行性克隆群的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析
　　系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)能夠直觀地表征出物種或群體的進(jìn)化路徑和先后關(guān)系。本研究基于三十余萬個(gè)SNP位點(diǎn)的變異信息，使用鄰接算法構(gòu)建了157株副溶血弧菌的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)，得到了157株菌的系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn):由于副溶血弧菌

5、群體中重組頻率高，掩蓋了豎向遺傳信號(hào)，使得系統(tǒng)發(fā)生樹中內(nèi)部節(jié)點(diǎn)的可靠性低、分支短，整體呈現(xiàn)輻射狀。雖然從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹中并不能清楚地得到群體中菌株進(jìn)化的先后順序，本研究仍然在這些樣品中鑒定出21個(gè)克隆群:共包含107株菌，其平均遺傳距離為281個(gè)SNP，遠(yuǎn)小于種群平均遺傳距離35，500個(gè)SNP。
　　克隆群內(nèi)部菌株分化時(shí)間相對較短，重組事件的數(shù)目相應(yīng)較少，因此可以根據(jù)SNP在基因組上的分布聚集情況被鑒定出來。本研究使用PAML

6、軟件包和RecHMM軟件分別推算了21個(gè)克隆群菌株種群內(nèi)部的重組事件，給出了克隆群菌株中重組片段的大小和位置并在流行性克隆群菌株的分析中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)覆蓋O抗原和K抗原編碼基因的重組熱點(diǎn)，長度158.5 kb。排除這些重組造成的影響后，本研究重建了流行性克隆群菌株的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)，在地理分布上，除一個(gè)子群中所有菌株分離自臺(tái)灣地區(qū)外，其他子群的菌株均分離自世界不同地區(qū)，表明該群菌株在全球范圍發(fā)生著迅速的擴(kuò)散。
　　全局種群結(jié)構(gòu)及海洋性基

7、因庫
　　連鎖失衡(linkage disequilibrium，LD)可以反映重組的程度，為量化比較副溶血弧菌種群重組大小，本研究中使用了Haploview軟件計(jì)算并比較了副溶血弧菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌、腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌以及霍亂弧菌的連鎖失衡水平，比較發(fā)現(xiàn)VP菌株在250 bp的時(shí)候其連鎖失衡的值便降到了初始值的一半，在對照物種中，只有幽門螺桿菌和大腸桿菌的下降速度比VP快，另外，副溶血弧菌群體中相距較

8、遠(yuǎn)的SNP的LD值比其他物種都低，其LD的觀測值與完全混合種群的理論預(yù)測值相當(dāng)。
　　為探討整個(gè)物種的種群結(jié)構(gòu)特征以及基因流向，本研究構(gòu)建了由71株菌組成的非冗余基因組集，包括50株非克隆群菌株以及每個(gè)克隆群中各挑選的一株代表性菌株。應(yīng)用種群結(jié)構(gòu)分析軟件ChromoPainter和fineSTRUCTURE對非冗余基因組集進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌由11個(gè)種群(Population)組成;其中包括8個(gè)主要由亞洲菌株組成的亞洲群(As

9、ia-pop)、1個(gè)北美菌株占主體的美洲群(US-pop)和兩個(gè)介于亞洲群和美洲群之間的混雜群(Hyb-pop)。其中，8個(gè)亞洲群共包含51株菌;美洲群和兩個(gè)混雜群分別包含3株、兩株和5株菌。亞洲群和美洲群的菌株的Fst值為0.071，其他各種群間的Fst也較低，說明所估計(jì)的亞洲群的核酸多樣性與整個(gè)種群的估計(jì)值是相近的;遷徙速率計(jì)算結(jié)果說明種群中所發(fā)生的遷徙事件很少。因此，亞洲群和美洲群菌株可能是由于地理隔離的原因，各自分享其獨(dú)特的基因

10、庫。
　　本研究分離自美洲的菌株較少。為進(jìn)一步確認(rèn)基因庫存在的可靠性，使用structure軟件對pubMLST數(shù)據(jù)庫中648株副溶血弧菌、7個(gè)看家基因的核酸序列進(jìn)行分析;綜合ChromoPainter的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與美洲群菌株有著高共祖率的ST型絕大部分來自墨西哥灣地區(qū)，另一方面，分離自墨西哥灣的大部分ST型都與美洲群菌株相關(guān)?？紤]到副溶血弧菌是一種海洋性細(xì)菌，結(jié)合其種群的地理分布可以確定，該物種至少存在兩個(gè)海洋性基因庫——亞

11、洲環(huán)太平洋沿岸基因庫和北美墨西哥灣基因庫。
　　副溶血弧菌的進(jìn)化推動(dòng)力分析
　　本研究分析表明，亞洲群的51株副溶血弧菌菌株代表的是一個(gè)自由混合的群體，因此可以使用群體遺傳學(xué)的方法來估算參數(shù)Ner（其中Ne代表有效種群大小，r代表某一位點(diǎn)每一代發(fā)生重組的概率），進(jìn)而分析其進(jìn)化推動(dòng)力。本研究中使用了兩種不同的方法來估計(jì)Ner的值，其中基于基因組上單個(gè)變異位點(diǎn)估計(jì)的Ner為9.8;基于整個(gè)有機(jī)體水平的Ner的估計(jì)值為268。中性

12、進(jìn)化條件下，兩種方法得到的Ner應(yīng)該一致，但實(shí)際結(jié)果是兩者相差27倍，這可能是由于該物種中存在有機(jī)體水平的選擇效應(yīng)，種群中穩(wěn)定保持著多種生態(tài)型，使得不同生態(tài)型間的菌株溯祖可能性降低，但是不一定會(huì)影響到那些非生態(tài)型選擇區(qū)域的變化。
　　生態(tài)型模型預(yù)測了基因組中存在上位相互作用位點(diǎn)，因此可以通過鑒定上位相互作用的存在與否來驗(yàn)證生態(tài)型模型的假設(shè)。通過370億次的fisher精確檢驗(yàn)，對基因組上所有SNP在菌株中的分布進(jìn)行了兩兩間的檢測，

13、并使用Q-Q圖對結(jié)果進(jìn)行了可視化，最終發(fā)現(xiàn)一組在基因組上相距400 kbp的SNP有顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系(p＜10-9)，即存在上位相互作用。通過SNP與基因組片段之間的分析，同樣檢測到上位相互作用位點(diǎn)的存在。本研究中發(fā)現(xiàn)的上位相互作用位點(diǎn)主要涉及Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)、受環(huán)鳥苷酸二聚體(c-di-GMP)調(diào)控的生物膜形成相關(guān)基因。在副溶血弧菌基因組中，這兩套系統(tǒng)的編碼基因不能共存，由此可見，這些上位相互作用位點(diǎn)受到強(qiáng)烈的自然選擇作用，與副溶